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膜联蛋白B2的结构与功能研究

作　者: 王娜
导　师: 孙树汉
学　校: 第二军医大学
专　业: 遗传学
关键词: 膜联蛋白B2 抗凝血活性猪囊尾蚴 DNA疫苗表达纯化突变体
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

膜联蛋白(annexin)家族是在真核生物中广泛存在,具有重要生理功能的一类钙依赖性磷脂结合蛋白。因其在Ca2+存在的情况下能够和酸性磷脂结合,所以又称为钙依赖性磷脂结合蛋白。膜联蛋白B2 (AnxB2)是本实验室从猪囊尾蚴cDNA文库中筛选得到的一个新的膜联蛋白B家族成员。它具有四个典型的annexin重复结构域,每个结构域包含一个“G-X-G-T-(38 residues)-D/E”基序,形成4个type II型Ca2+结合位点;经生物信息学分析可知,AnxB2分子结构中包含15个抗原表位;AnxB2在II和III结构域之间存在2个独特的“插入片段”和一个“赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(KGD)”序列并且AnxB2还具有一个独特的粘多糖附着位点(G-AS)。我们根据AnxB2已有的结构特征来研究AnxB2的生物功能,为AnxB2功能的进一步研究奠定基础。本课题的研究分为三个方面:1、从猪带绦虫六钩蚴中克隆出AnxB2基因,证明AnxB2在六钩蚴阶段表达。接着借助计算机同源模建技术构建了4个AnxB2突变体M234,M134,M124,M123。用基因重组技术将AnxB2及其突变体分别构建到真核表达载体pcDNA3.1中,并用阳离子脂质体介导的方法转染真核细胞,检测结果表明构建的真核质粒能够表达相应的目的蛋白;同时也构建了AnxB2突变体的原核表达载体并用亲和层析技术纯化相关蛋白。另外,利用膜联蛋白的钙依赖性磷脂结合活性构建的pJLA503-AnxB2表达载体使AnxB2在大肠杆菌中实现了高表达;接着采用钙离子介导的沉淀反应来初步纯化重组蛋白;随后用离子交换层析技术进一步纯化蛋白。用改良的纯化方法,我们制备出高纯度和高生物活性的AnxB2。2、对AnxB2进行免疫学方面的研究。将真核表达质粒分别免疫BALB/c纯系鼠,以间接ELISA检测免疫小鼠血清的抗体应答水平;淋巴细胞增殖实验检测免疫动物CD4+T细胞的活化状态;淋巴细胞细胞因子试验检测免疫小鼠的细胞免疫应答水平。结果表明,免疫注射的DNA疫苗虽然均能诱导Th1型免疫应答反应,但是它们诱导机体产生的免疫应答水平不同:pcDNA3.1-M234组诱导的抗体水平最低和pcDNA3.1-M123组分泌的IFN-γ水平最低;“DNA prime-protein boost”组诱导的抗体水平和分泌的IFN-γ水平最高。根据结果,我们可以推断:M234缺失的抗原表位为B细胞表位,而M123缺失的表位是T细胞表位;“DNA prime-protein boost”策略可有效增强机体的特异性免疫应答。3、对AnxB2进行抗凝血活性方面的研究。结果表明:AnxB2具有外源性抗凝血活性;与活化血小板结合的能力更强(versus AnxB1)。从结果我们可知,用改良的纯化方法制备的AnxB2保留了原来的生物活性,验证了这种纯化方法的可行性。随后对AnxB2突变体M123、M234进行抗凝血活性和免疫原性研究。结果表明,M234不仅较好的保留了野生型AnxB2的抗凝血活性,而且免疫原性降低,这为进一步研究膜联蛋白AnxB2的抗凝血功能和研制高效、低免疫原性的靶向溶栓剂奠定了基础。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
缩略词表  9-10
前言  10-12
第一章膜联蛋白B2 及其突变体核酸疫苗诱导的小鼠免疫应答  12-38
  一、实验材料  12-15
  二、实验方法  15-25
  三、实验结果  25-33
  四、讨论  33-36
  五、参考文献  36-38
第二章膜联蛋白 B2 的抗凝血功能分析  38-53
  一、实验材料  38-39
  二、实验方法  39-43
  三、实验结果  43-49
  四、讨论  49-51
  五、参考文献  51-53
总结  53-54
膜联蛋白的结构与功能研究(综述)  54-64
硕士期间发表论文  64-65
致谢  65

膜联蛋白B2的结构与功能研究

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