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基于线粒体膜间隙蛋白质相互作用网络的基因功能研究

作　者: 曾志锋
导　师: 杨晓明
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 线粒体蛋白质-蛋白质相互作用 MCFP Tim23 IMMT 凋亡
分类号: Q3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 98次
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内容摘要

线粒体是真核细胞的重要细胞器,是细胞内氧化磷酸化和产生ATP的主要场所。线粒体的超微结构由内外两层膜封闭,包括外膜、内膜、膜间隙和基质四个功能区。线粒体膜间隙(mitochondrial intermembrane space, IMS)是指线粒体内膜和外膜之间的腔隙,宽约6-8nm,其中充满无定形的液体、可溶性酶、底物和辅助因子等。虽然目前明确定位于线粒体膜间隙的蛋白质只有34种,但其涉及诸多方面的生理功能,包括细胞呼吸、细胞凋亡、蛋白质转运等。这些生理功能的正常进行,不仅依赖单个蛋白质,更多地是通过多个蛋白质之间的相互协同(或拮抗)来完成。因此,研究线粒体膜间隙蛋白质相互作用,对于深入理解线粒体功能,阐明线粒体相关疾病的致病机理,有着重要的意义。虽然关于单对线粒体膜间隙蛋白质的相互作用已多有报道,但系统研究线粒体膜间隙蛋白质相互作用网络并在此基础上理解和把握线粒体膜间隙的各种生理功能调控尚未见报道。本实验室前期通过酵母双杂交大规模筛选了线粒体膜间隙蛋白质间相互作用,共得到49对膜间隙蛋白质间的相互作用,并初步构建了线粒体膜间隙蛋白质相互作用网络。虽然酵母双杂交技术具有高通量,规模化等优点,但它也存在假阳性及假阴性的缺点。为验证筛选结果的可靠性,本研究采用GST-pull down技术验证了前期筛选的12对相互作用,共得到6对阳性结果及6对阴性结果,加上前期他人验证的6对中的5对阳性结果,所获相互作用数据GST-pull down技术验证阳性率约为61 %(11/18),表明我们酵母双杂交所获相互作用数据具有大量可经其它方法验证的相互作用,具有较好的可靠性。蛋白质相互作用网络的研究可揭示未知功能蛋白质的功能线索或作用机制。在对所构建网络进行分析的基础上,我们采用多种实验对网络涉及的两种蛋白质SLC25A40(简称MCFP)和IMMT(又称mitofilin)的功能进行了研究。MCFP是线粒体转运蛋白质家族新成员。该家族成员由细胞质合成,经特定的转运机制,运输入线粒体,并定位于线粒体内膜,负责小分子物质跨线粒体内膜的转运。但目前关于MCFP的生理功能尚未阐明。我们运用RNAi、蓝色温和电泳、质谱分析等技术研究发现,下调HEK293细胞中MCFP的表达,导致细胞出现ATP合酶活性显著下降、ATP产量减少、线粒体活性氧自由基含量增高、超氧化物歧化酶活性下降、细胞存活能力减低等一系列功能异常表现。我们的结果提示, MCFP是一个与线粒体功能密切相关的功能蛋白质。Tim23复合体是线粒体内膜上主要的蛋白质转运复合体之一,大部分的线粒体基质蛋白质,部分的线粒体内膜蛋白质,都由其转运入线粒体。Tim23是该复合体的核心孔道蛋白质,对于线粒体蛋白质转运至关重要。研究表明,Tim23的降解与细胞凋亡及多种神经退行性疾病相关。IMMT又称mitofilin,是线粒体内膜上重要的膜蛋白质分子,对于线粒体内膜脊的形态维持至关重要,并与细胞凋亡密切相关。通过GST-pull down、免疫共沉淀、以及共定位实验,我们证明IMMT与Tim23存在相互作用并共定位于线粒体。采用慢病毒感染的策略,我们成功构建了稳定表达IMMT的Hela细胞株。以此为基础,我们进一步研究了在1μg/ml表阿霉素作用下,过表达IMMT对细胞凋亡及Tim23蛋白质水平的影响。研究发现,过表达IMMT可以有效地抑制表阿霉素作用下Tim23的降解,延缓细胞凋亡进程。这一发现,一方面为阐明IMMT与Tim23相互作用的功能奠定了基础,另一方面为治疗Tim23相关的某些神经退行性疾病提供了新思路。

全文目录

中文摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-15
主要仪器设备和常用试剂的配制  15-18
英文缩略语  18-19
第一部分线粒体膜间隙蛋白质相互作用的验证  19-35
  一、材料与方法  19-24
  二、结果  24-30
  三、讨论  30-32
  四、小结  32-33
  参考文献  33-35
第二部分线粒体转运蛋白质家族成员SLC25A40 功能初探  35-52
  一、材料与方法  35-41
  二、结果  41-48
  三、讨论  48-50
  四、参考文献  50-52
第三部分基于IMMT 与Tim23 相互作用的功能研究  52-65
  一、材料与方法  52-55
  二、结果  55-60
  三、讨论  60-63
  参考文献  63-65
总结  65-66
  一、研究结论  65
  二、研究展望  65-66
附录一：GST-pull down 中所构建的真核及原核表达载体  66-67
附录二：实验用引物  67-68
综述：线粒体转运蛋白质家族  68-79
  参考文献  75-79
个人简历  79-80
致谢  80

基于线粒体膜间隙蛋白质相互作用网络的基因功能研究

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