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天花粉蛋白(Trichosanthin, TCS)是天花粉的主要成分,属于Ⅰ型核糖体失活蛋白(Ribosome-Inactivating Protein, RIP),该药不仅已应用于临床妊娠终止,而且在肿瘤治疗方面也具有潜在的应用价值。TCS通过调控bax基因诱导小鼠前列腺癌细胞RM-1凋亡,通过CREB蛋白(循环AMP反应元素结合蛋白)抑制Hela细胞中Bcl-2的表达,从而抑制Hela细胞增殖,诱导其凋亡。对于免疫系统,一方面,TCS可以上调正常人外周血CD4+T细胞比例,下调CD8+T细胞比例,增大CD4+/CD8+的比值。另一方面,TCS又可以促进人外周血单核细胞分泌IL-2,发挥其抗肿瘤作用。那么,TCS作为一种潜在的抗肿瘤药物,其对荷瘤个体免疫系统的功能影响如何?TCS是有利于机体诱导产生抗肿瘤免疫效应还是对肿瘤免疫起抑制作用……,所有这些均系TCS作为潜在的临床抗肿瘤药物开发研究首先需要回答的关键问题。为了阐述上述问题,我们首先观察了TCS对3LL肿瘤细胞及3LL肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长的作用,在明确TCS体内外可以抑制肿瘤生长的基础上,进一步研究TCS对免疫系统T细胞亚群的格局及功能,探讨TCS的免疫作用机制,为TCS作为抗肿瘤药物应用于肿瘤免疫治疗提供理论及实验依据。第一部分天花粉蛋白对肿瘤细胞的抑制作用为验证天花粉蛋白是否具有抑制肿瘤生长的特性,我们以3LL肿瘤细胞株为研究对象。结果显示TCS可抑制3LL肿瘤细胞增殖并诱导凋亡,且IC50为50μg/ml。将3LL肿瘤细胞接种至T细胞免疫缺陷的裸鼠体内,实验组自肿瘤长到1mm×1mm后,隔天每只小鼠瘤旁注射TCS 0.4mg/kg,共注射5次。结果显示,TCS对裸鼠体内3LL肿瘤的生长具有一定的抑制作用,肿瘤生长变缓,但最终还是持续生长直至被处死,提示TCS具有一定的抗肿瘤效应。有研究表明TCS对正常小鼠免疫系统有一定的抑制作用。为了解TCS这一特性是否影响其在小鼠体内的抗肿瘤效应,我们以C57BL/6小鼠3LL肿瘤模型为研究载体。结果显示,TCS处理组小鼠可完全抑制肿瘤在体内的生长,并且使小鼠获得100%的生存率,而对照组小鼠肿瘤则持续生长至被处死。表明TCS对3LL的抗肿瘤作用难以完全用TCS对肿瘤细胞直接抑制作用来解析,提示宿主免疫系统可能也正向参与了机体的抗肿瘤免疫效应。第二部分TCS在Lewis肺癌小鼠模型中的抗肿瘤免疫作用通过第一部分体内外的实验证实TCS不仅可直接抑制3LL肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡,而且免疫系统也可能帮助TCS在体内抑制肿瘤的生长。由于文献报道TCS对正常免疫系统存在一定的抑制作用,在本部分中,我们首先研究本课题所用TCS剂量及治疗方法对正常小鼠免疫系统的影响。以TCS体内处理正常小鼠,取出淋巴结及脾脏淋巴细胞,发现CD3+T细胞比例较未处理组有一定下降,其中以CD8+T细胞亚群比例改变更为显著,而B,NK,DC细胞比例变化不明显,表明TCS主要改变了T细胞亚群的比例。接着我们采用FACS检测了各亚群T细胞分泌细胞因子的变化,发现Thl型细胞因子IFN-γ及Th2型细胞因子IL-4的表达水平均有所降低,提示我们实验中所用的TCS剂量对正常小鼠的T淋巴细胞有一定的抑制作用,但该抑制作用较文献报道的弱,可能是由于TCS处理小鼠的剂量及方案有所不同导致。TCS对肿瘤细胞本身有抑制增殖和促进凋亡的功能,而对正常免疫系统又有一定的抑制作用。我们在C57BL/6荷瘤小鼠体内的实验结果却提示,免疫系统参与了TCS体内抗肿瘤的过程。因此,我们进一步检测TCS在肿瘤环境下对小鼠体内免疫系统的影响。发现CD3+T细胞比例较未处理组有显著升高,而B,NK,DC细胞比例变化不明显,表明TCS主要改变了T细胞亚群的比例。同样,我们检测了各亚群T细胞分泌细胞因子的情况,Thl型细胞因子IFN-γ的分泌升高,而IL-4的表达水平则下降,说明经TCS治疗的荷瘤小鼠体内Th1型反应处于优势状态,Th2型反应处于弱势状态,Th1/Th2平衡向Th1方向漂移,有利于机体的抗肿瘤免疫反应。该部分的结果与TCS对正常小鼠免疫系统的影响不同,这有可能是由于TCS注射入瘤后,改变了肿瘤微环境导致免疫格局发生变化。最后,我们选择经TCS治疗有效,并存活超过100天的小鼠。再次将1×1053LL肿瘤细胞接种到小鼠左侧腹股沟皮下,并于右侧腹股沟皮下接种1×106的FBL3无关肿瘤细胞,对照组为正常小鼠。结果显示,TCS治疗有效的小鼠,可完全抵御第二次3LL肿瘤细胞的攻击,正常小鼠组肿瘤持续生长。但FBL3在两组小鼠中均成瘤,并持续生长,两组无显著性差异。FACS检测小鼠体内记忆T细胞的结果也发现,TCS治疗组小鼠的记忆T淋巴细胞(CD44+CD62L-T细胞)比例明显高于未治疗组,提示TCS治疗后,诱导机体产生了针对3LL的特异性免疫记忆。因此,TCS在肿瘤微环境下诱导了增强的抗肿瘤免疫应答,提高抗肿瘤免疫记忆,达到抗肿瘤的作用。第三部分TCS抗肿瘤免疫作用机制的初步探讨TCS对肿瘤细胞本身有抑制增殖和促进凋亡的功能,能使正常小鼠的免疫系统抑制,但在肿瘤微环境下,TCS可增强小鼠体内的抗肿瘤免疫反应及免疫记忆。我们推测TCS在荷瘤小鼠中对免疫系统的增强作用可能通过改变3LL肿瘤细胞的抗原性及免疫原性来实现的。在本部分中,我们对天花粉蛋白TCS治疗小鼠肿瘤消退的机制进行初步探讨。为验证TCS在荷瘤小鼠中对免疫系统的增强功能是通过改变3LL肿瘤细胞的特性而介导的,我们将肿瘤小鼠的T细胞与TCS处理的3LL肿瘤细胞共孵,发现T淋巴细胞的增殖功能与对照组差异显著,其分泌的具有促进杀伤功能的细胞因子IFN-γ显著增高,而对抗肿瘤免疫微环境中具有抑制功能的细胞因子IL-4和IL-10却有明显下降。随后,我们检测TCS处理过的3LL肿瘤细胞表面分子表达的异常,发现TCS处理的3LL肿瘤细胞表面MHCⅠ类分子及协同刺激分子均有不同程度的提高,提示TCS可能通过上调3LL肿瘤细胞的抗原性来诱导增强的抗肿瘤免疫应答。另一方面,我们发现TCS可明显上调抑癌蛋白TSLC1在3LL肿瘤细胞中的表达,该抑癌蛋白与表达在活化T细胞上的配体CRTAM结合,促进T细胞的增殖及Th1型细胞因子IFN-γ的分泌等,显著增强T细胞的抗肿瘤作用。综上所述,在C57BL/6小鼠3LL肺癌肿瘤模型中,使用天花粉蛋白治疗后,可显著促进CD3+T细胞的增殖,并诱导其细胞因子分泌类型偏向Th1型,有效的增强了抗肿瘤免疫应答,最终抑制肿瘤生长,显著提高小鼠生存率。
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