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产木聚糖酶菌株的筛选、酶的分离纯化及酶学性质的研究

作　者: 戚永跃
导　师: 谢占玲
学　校: 青海大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 拟盘多毛孢属木聚糖酶筛选分离纯化酶学性质
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 54次
引　用: 1次
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内容摘要

对实验室产木聚糖酶的4个属的10株真菌进行筛选,得到一株具有高效木聚糖降解能力的菌株50647。通过ITS序列分析,并结合形态学鉴定确定其属于拟盘多毛孢属。该菌以燕麦秸秆粉和麸皮不溶性木聚糖作为碳源,于25℃条件下,120r/min摇瓶光照培养,第3天发酵液中木聚糖酶活力达到峰值为49.3U/ml,酶的比活力为1066.2U/mg。培养第9天后发酵液中木聚糖酶酶活力为34.3 U/ml,是酶活力峰值的70%左右。SDS-PAGE及酶谱分析表明该菌能够产生6种不同分子量大小的木聚糖酶组分,分别定义为组分A、B、C、D、E、F。其中组分A属于低分子量木聚糖酶,其他木聚糖酶组分均属于高分子量木聚糖酶。采用硫酸铵分级沉淀,两步Sephacryl S-100凝胶过滤层析和DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析等方法从50647菌株的粗酶液中分离得到一种低分子量木聚糖酶XYL-A。经SDS-PAGE检测达到电泳纯,其相对分子质量为20.6KDa。在整个纯化过程中,XYL-A的纯化倍数为28.1,回收率为2.0。木聚糖酶酶学性质表明,XYL-A的最适反应pH和温度分别为pH 5.5和40℃,在pH 5-6的范围内具有很好的稳定性,XYL-A的在40℃以下稳定性很好,超过40℃酶活力迅速降低。金属离子Mn²⁺、Na⁺、K⁺对木聚糖酶XYL-A有激活作用,Fe²⁺在4mM条件下对该酶具有一定的抑制作用,而Hg⁺则完全抑制木聚糖酶的酶活性。XYL-A具有很强的底物特异性。专一性的作用于木聚糖底物,而对其他一些底物如羧甲基纤维素、纤维素、淀粉、果胶不具有酶活性。以Birchwood木聚糖为底物采用双倒数作图法测得最大反应速率为175.44umol/min·mg,米氏常数为18.14mg/ml。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
第1章引言  10-23
  1.1 木聚糖及其化学结构  10-11
  1.2 木聚糖酶  11-15
    1.2.1 木聚糖酶的分类  11-12
    1.2.2 木聚糖降解酶系统  12-13
    1.2.3 木聚糖酶的结构和功能  13-14
    1.2.4 木聚糖酶的生产菌株  14-15
  1.3 木聚糖酶的分离纯化  15-20
    1.3.1 样品的提取  16
    1.3.2 样品的浓缩  16-18
    1.3.3 层析技术  18-19
    1.3.4 蛋白质电泳技术  19-20
  1.4 木聚糖酶的应用  20-22
    1.4.1 木聚糖酶在造纸工业中的应用  20-21
    1.4.2 木聚糖酶在饲料行业中的应用  21
    1.4.3 木聚糖酶在食品行业中的应用  21
    1.4.4 木聚糖酶在其它方面的应用  21-22
  1.5 研究目的及意义  22-23
    1.5.1 研究目的  22
    1.5.2 研究意义  22-23
第2章木聚糖酶产生菌的筛选  23-33
  2.1 引言  23
  2.2 实验材料  23-24
    2.2.1 菌株及培养基  23-24
      2.2.1.1 菌株  23
      2.2.1.2 培养基  23-24
    2.2.2 主要药品和试剂  24
    2.2.3 主要仪器设备  24
  2.3 实验方法  24-26
    2.3.1 木聚糖酶活力测定  24-25
    2.3.2 蛋白含量测定  25-26
    2.3.3 菌株的培养及筛选  26
  2.4 结果与分析  26-31
    2.4.1 木糖标准曲线绘制  26-27
    2.4.2 蛋白标准曲线绘制  27-28
    2.4.3 菌株的筛选  28-30
    2.4.4 50647 的产酶曲线  30-31
  2.5 讨论  31-33
第3章低分子量木聚糖酶XYL-A 的分离纯化  33-48
  3.1 引言  33
  3.2 实验材料  33-34
    3.2.1 菌株  33
    3.2.2 主要药品，试剂  33-34
    3.2.3 主要仪器设备  34
  3.3 实验方法  34-38
    3.3.1 木聚糖酶酶活力测定  34-35
    3.3.2 蛋白含量的测定  35
    3.3.3 木聚糖酶的分离纯化  35-36
    3.3.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  36-38
    3.3.5 酶谱分析  38
    3.3.6 蛋白质分子量的测定  38
  3.4 结果与分析  38-46
    3.4.1 粗酶液SDS-PAGE 及酶谱分析  38-40
    3.4.2 木聚糖酶XYL-A 的分离纯化  40-44
      3.4.2.1 硫酸铵分级沉淀  40-41
      3.4.2.2 第一次Sephacry S-100 凝胶过滤层析  41-42
      3.4.2.3 DEAE 离子交换层析  42-43
      3.4.2.4 第二次Sephacry S-100 凝胶过滤层析  43-44
    3.4.3 XYL-A 的纯度检测及分子量测定  44-46
  3.5 讨论  46-48
第4章木聚糖酶XYL-A 酶学性质的研究  48-55
  4.1 引言  48
  4.2 实验材料  48
  4.3 实验方法  48-50
    4.3.1 酶的最适反应pH 及pH 稳定性  48-49
    4.3.2 酶的最适反应温度及温度稳定性  49
    4.3.3 酶底物特异性  49
    4.3.4 金属离子对酶活力的影响  49
    4.3.5 酶促反应中动力学参数的测定  49-50
  4.4 结果与分析  50-53
    4.4.1 木聚糖酶XYL-A 的最适pH 及pH 稳定性  50-51
    4.4.2 木聚糖酶XYL-A 的最适温度及温度稳定性  51
    4.4.3 金属离子对木聚糖酶XYL-A 的影响  51-52
    4.4.4 XYL-A 的底物特异性  52-53
    4.4.5 XYL-A 的Km 值及Vmax 的测定  53
  4.5 讨论  53-55
第5章结论  55-57
  5.1 研究总结  55-56
  5.2 展望  56-57
参考文献  57-63
致谢  63-64
附录  64-67
作者简介  67

产木聚糖酶菌株的筛选、酶的分离纯化及酶学性质的研究

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