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蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞中G蛋白偶联受体激酶2的作用及芍药苷对其的影响

作　者: 凌琳
导　师: 魏伟
学　校: 安徽医科大学
专　业: 药理学
关键词: 佐剂性关节炎 滑膜细胞 G蛋白偶联受体激酶 蛋白酪氨酸磷酸酶 芍药苷
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的:根据佐剂性关节炎（adjuvant arthritis,AA）大鼠的足爪肿胀、评分、关节滑膜及病理形态学等改变,观察芍药苷（paeoniflorin,Pae）对AA大鼠巨噬细胞分泌Il-1水平、T、B细胞增殖水平的影响;在整体、器官、细胞水平上明确Pae对AA大鼠的治疗作用;以AA发病的靶细胞—成纤维滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）为突破口,观察Pae对AA大鼠FLS的增殖、cAMP水平、含有SH2结构域的酪氨酸蛋白磷酸酶（ Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase-2,SHP-2）、G蛋白偶联受体激酶2（G-protein-coupled receptor kinases 2,GRK2）表达的影响;分析Pae是否通过影响SHP-2在AA大鼠FLS中的表达情况而发挥效应。明确SHP-2在FLS中调节GRK2的作用及Pae治疗大鼠AA的可能的分子机制。方法:大鼠左后足跖皮内注射弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant,FCA）制备大鼠AA模型;以Pae(25、50、100 mg·kg-1)灌胃给药（intragastric administration, ig）（d14-d24）。计数法测定多发性关节炎指数,称重法测定脾脏指数, ELISA法检测巨噬细胞分泌IL-1水平,氚标记的胸腺嘧啶核苷掺入法测定T、B淋巴细胞增殖反应,HE染色法光镜观察关节病理形态学变化等。组织块法培养大鼠FLS,MTT法检测FLS的增殖反应;放射性免疫法测定FLS cAMP水平;Western blot技术检测FLS中GRK2、SHP-2的表达变化。结果:1. Pae对AA大鼠的治疗作用Pae(25、50、100 mg·kg-1)于造模后d14- d24灌胃给药均不同程度明显减轻AA大鼠多发性关节炎指数、继发侧肿胀度、升高的脾脏指数、升高的巨噬细胞分泌IL-1水平、增强的T、B淋巴细胞增殖反应及关节病理形态改变等方面都有不同程度的改善作用。光镜下观察关节滑膜组织中轻度的滑膜增生、淋巴细胞浸润减少;滑膜下有少量纤维增生、血管翳减轻;软骨受损程度减轻,仅见少量炎细胞;骨髓腔中脂肪细胞明显减少、骨骼细胞密集。充分显示了Pae对AA大鼠具有治疗作用。2. SHP-2抑制剂NSC-87877对AA大鼠FLS增殖、胞内cAMP水平、GRK2及SHP-2表达的影响加入SHP-2抑制剂（NSC-87877）(10-5 mol·L-1)后,可显著抑制AA大鼠FLS的过度增殖,升高细胞内cAMP水平,降低AA大鼠FLS中GRK2、SHP-2的高表达水平;分离FLS胞浆、胞膜蛋白,应用Western-blot方法,检测显示加入NSC-87877(10-5 mol·L-1)能显著降低AA大鼠FLS细胞膜中GRK2蛋白的高表达水平,显著升高AA大鼠FLS细胞浆中GRK2蛋白的低表达水平。3. Pae对AA大鼠FLS增殖、胞内cAMP水平、GRK2及SHP-2表达的影响Pae(10-5、10-6、10-7、10-8 mol·L-1)体外给药后,可显著抑制EP2受体激动剂（Butaprost）刺激的AA大鼠FLS的过度增殖,升高细胞内cAMP水平,降低AAWestern-blot方法,检测显示Pae(10-5、10-6、10-7、10-8 mol·L-1)体外给药能显著降低AA大鼠FLS细胞膜中GRK2蛋白的高表达水平,显著升高AA大鼠FLS细胞浆中GRK2蛋白的低表达水平。结论:1、Pae对AA大鼠有一定的治疗的作用,对其多发性关节炎指数、升高的脾脏指数、继发侧肿胀度、升高的巨噬细胞分泌IL-1水平、增强的T、B淋巴细胞增殖反应及关节病理形态改变具有明显的改善作用。2、SHP-2抑制剂可下调AA大鼠滑膜细胞GRK2和SHP-2的高表达;降低细胞增殖水平,升高胞内cAMP水平;同时使胞膜GRK2水平降低,而升高胞浆GRK2水平。提示SHP-2可能促进了GRK2的转膜,下调胞内cAMP水平,进而影响细胞增殖。3、Pae(10-5、10-6、10（-7）、10-8 mol·L-1)体外给药,可不同程度地降低Butaprost刺激的AA大鼠FLS的异常增殖,下调SHP-2和GRK2的高表达,提示下调SHP-2和GRK2可能是Pae抑制FLS异常增殖的机制之一。

全文目录


英文缩略词表  7-9
摘要  9-12
Abstract  12-15
1 前言  15-16
2 实验材料  16-20
  2.1 动物  16-17
  2.2 药物与试剂  17-19
  2.3 仪器与设备  19-20
3 实验方法  20-26
  3.1 大鼠 AA 模型的诱导  20-21
  3.2 动物分组及给药方案  21
  3.3 AA 大鼠继发侧关节肿胀度的测定  21
  3.4 AA 大鼠关节炎指数评分  21
  3.5 AA 大鼠脾脏指数的测定  21
  3.6 AA 大鼠踝关节病理形态的观察  21
  3.7 ConA 和LPS 诱导的T 和B 淋巴细胞增殖反应  21-22
  3.8 IL-1 的诱生与检测  22
  3.9 滑膜细胞的分离与培养  22
  3.10 NSC-87877 作用下 AA 大鼠 FLS 增殖反应  22
  3.11 Pae作用下AA大鼠FLS增殖反应  22-23
  3.12 NSC-87877作用下AA大鼠FLS产生cAMP水平的检测  23
  3.13 Pae 作用下AA 大鼠FLS 产生cAMP 水平的检测  23
  3.14 Western blot 检测 FLS 中 GRK2、SHP-2 蛋白表达与 FLS 中胞浆和胞膜 GRK_2 蛋白表达  23-26
    3.14.1 细胞样品的制备  23-24
    3.14.2 蛋白定量  24
    3.14.3 Western blot 操作步骤  24-26
  3.15 统计学处理  26
4 实验结果  26-42
  4.1 Pae 对AA 大鼠的治疗作用  26-30
    4.1.1 Pae 对AA 大鼠继发侧关节肿胀度的影响  26-27
    4.1.2 Pae 对AA 大鼠多发性关节炎指数的影响  27
    4.1.3 Pae 对AA 大鼠脾脏指数的影响  27-28
    4.1.4 Pae 对 AA 大鼠腹腔巨噬细胞产生 IL-1 的影响  28
    4.1.5 Pae 对AA 大鼠T、B 细胞增殖反应的影响  28-29
    4.1.6 Pae 对 AA 大鼠踝关节病理学的影响  29-30
   4.2 SHP-2 抑制剂对 AA 大鼠滑膜细胞增殖反应、cAMP 水平及 GRK_2 表达的影响  30-37
    4.2.1 滑膜细胞培养结果  30-31
    4.2.2 不同浓度NSC-87877 对AA 大鼠FLS 增殖能力的影响  31-32
    4.2.3 不同时间点NSC-87877 对AA 大鼠FLS 增殖能力的影响  32-33
    4.2.4 NSC-87877 对前列腺素受体EP2 激动剂（Butaprost）影响AA大鼠FLS 增殖能力的作用  33
    4.2.5 NSC-87877 对Butaprost 影响AA 大鼠FLS 产生cAMP 水平的作用  33-34
    4.2.6 NSC-87877 对AA 大鼠滑膜细胞GRK_2、SHP-2 表达的影响  34-35
    4.2.7 NSC-87877 对AA 大鼠滑膜细胞GRK_2 胞膜表达的影响  35-36
    4.2.8 NSC-87877 对AA 大鼠滑膜细胞GRK_2 胞浆表达的影响  36-37
  4.3 Pae 对AA 大鼠滑膜细胞增殖反应、cAMP 水平及GRK_2 表达的影响  37-42
    4.3.1 Pae 对Butaprost 影响AA 大鼠FLS 增殖能力的作用  37-38
    4.3.2 Pae 对Butaprost 影响AA 大鼠FLS 产生cAMP 水平的作用  38-39
    4.3.3 Pae 对AA 大鼠滑膜细胞GRK_2、SHP-2 表达的影响  39-40
    4.3.4 Pae 对AA 大鼠滑膜细胞GRK_2 胞膜表达的影响  40-41
    4.3.5 Pae 对AA 大鼠滑膜细胞GRK_2 胞浆表达的影响  41-42
5 讨论  42-47
  5.1 Pae 发挥治疗AA 大鼠作用与其调节AA 大鼠滑膜细胞的水平及巨噬细胞异常的分泌功能有密切关系  42-44
  5.2 影响GRK_2 的转膜可能是SHP-2 在AA 大鼠滑膜细胞中调节GRK_2 的重要机制  44-46
  5.3 影响SHP-2 的表达可能是Pae 发挥调控GRK_2的重要机制之一  46-47
6 结论  47
参考文献  47-53
附录  53-54
致谢  54-56
综述 蛋白酪氨酸磷酸酶的研究进展  56-66
  参考文献  62-66

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学 > 中药实验药理
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