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赤拟谷盗iap基因的克隆、表达模式及其分子进化分析

作　者: 胡婧
导　师: 周青春
学　校: 华中师范大学
专　业: 动物学
关键词: 赤拟谷盗 caspases酶 细胞凋亡 凋亡抑制蛋白IAP 杆状病毒表达(Bac to Bac)系统
分类号: S379.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 23次
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内容摘要


细胞凋亡在生物体的发育、维持体内稳态和免疫抵御外界侵害等方面发挥着重要的作用。凋亡抑制蛋白(IAP)是一系列包含一到三个baculovirus IAP repeats (BIR)结构域的蛋白家族,它通过结合caspases,发挥其抑制细胞凋亡的作用,同时它也受到IAP抑制因子的调节。本研究对鞘翅目昆虫赤拟谷盗(Tribolium castaneum)体内的两个细胞凋亡抑制蛋白基因(Tiap1和Tiap2)进行了克隆,其中Tiap1全长1017bp,其中含有两个BIR结构域和一个RING环,Tiap2全长1485bp,其中含有三个BIR结构域和一个RING环。推测的TIAP1蛋白和家蚕中的IAP (GENE ID:692576)相似性最高,相似度为55.95%,而TIAP2和果蝇中的IAP2 (GENE ID:36748)最相似,相似度为53.37%。系统进化树分析显示,TIAP1和TIAP2因功能结构域BIR数目不同而没有聚为一支,同时TIAP1的BIR2结构域与TIAP2的BIR3更为相似而不是与TIAP2的BIR2相似。这暗示有的iap基因BIR拷贝在昆虫发生之前就可能发生了丢失,而导致分化。同时为了进一步研究Tiap1和Tiap2的时空表达,用半定量RT-PCR研究两个目的基因在赤拟谷盗幼虫发育中的13、15、17、19、21、23和25日龄七个时期的表达量的差异,发现Tiap1和Tiap2均恒量表达,并表达量较高。说明iap基因在幼虫整个生长发育期间均起重要的作用。利用杆状病毒表达系统,成功构建了三个重组杆状病毒Bacmid-Tiapl, Bacmid-Tiap2, Bacmid-Mx,为进一步进行其功能方面的研究打下基础。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-8
1.前言  8-17
  1.1 IAP蛋白研究概况  8-15
    1.1.1 IAP蛋白家族  9
    1.1.2 IAP蛋白家族的分子结构  9-10
    1.1.3 IAP蛋白调节细胞凋亡的作用  10-12
    1.1.4 IAP蛋白调节泛素化过程  12
    1.1.5 IAP和IAP抑制蛋白  12-14
    1.1.6 IAP的其它作用  14-15
  1.2 杆状病毒表达系统(Bac to Bac系统)  15
  1.3 本实验的研究目的及意义  15-17
2.材料与方法  17-29
  2.1 实验材料  17-20
    2.1.1 材料来源和饲养方法  17
    2.1.2 实验样本的搜集  17
    2.1.3 主要试剂  17-18
    2.1.4 所用引物  18
    2.1.5 实验中主要溶液的配置  18-20
    2.1.6 主要实验设备和仪器  20
  2.2 实验方法  20-29
    2.2.1 赤拟谷盗幼虫的收集  20
    2.2.2 赤拟谷盗幼虫总RNA的提取  20-21
    2.2.3 赤拟谷盗幼虫各个时期总RNA的提取  21
    2.2.4 反转录,单链cDNA的合成  21-22
    2.2.5 PCR反应  22-23
    2.2.6 Tiap1和Tiap2在赤拟谷盗幼虫不同发育时期的表达量分析  23
    2.2.7 含目的基因的杆状病毒的构建(Bac to Bac)  23-29
3.结果与分析  29-48
  3.1 赤拟谷盗Tiap1和Tiap2目的基因的克隆  29-32
  3.2 Tiap1和Tiap2的序列相似性分析  32-39
  3.3 TIAP1和TIAP2蛋白二级结构的预测  39-42
    3.3.1 TIAP1蛋白二级结构的预测  39-41
    3.3.2 TIAP2蛋白二级结构的预测  41-42
  3.4 TIAP1和TIAP2蛋白三级结构的预测  42-43
  3.5 Tiap1和Tiap2基因在赤拟谷盗不同发育时期的表达量分析  43-44
    3.5.1 赤拟谷盗幼虫7个日龄总RNA的提取和检测  43-44
    3.5.2 半定量RT-PCR检测  44
  3.6 含有Tiap1,Tiap2,Mx-ag的杆状病毒的构建  44-48
    3.6.1 目的基因与载体pFastBac~(TM)1连接  44-45
    3.6.2 重组Bacmid的形成  45-46
    3.6.3 提取纯化重组Bacmid  46-47
    3.6.4 转染sf9细胞,获得杆状病毒  47-48
4.讨论  48-51
  4.1 赤拟谷盗iaps基因的克隆、序列特征  48
  4.2 表达模式分析  48
  4.3 赤拟谷盗IAPs分子进化分析  48-49
  4.4 重组Bacmid和昆虫杆状病毒的构建  49-51
参考文献  51-54
在校期间论文发表情况  54-55
致谢  55

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中图分类: > 农业科学 > 农学（农艺学） > 农产品收获、加工及贮藏 > 贮藏 > 防潮、防霉处理，防虫、防鼠、防火
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