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青蒿琥酯对K562细胞系增殖、凋亡的影响及其机制研究

作　者: 杨营营
导　师: 潘崚；王颖
学　校: 河北医科大学
专　业: 内科学
关键词: 青蒿琥酯凋亡 Bcl-2 Bax Bcl-rambo Caspase-3 Survivin K562细胞
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一组起源于造血干/祖细胞的恶性克隆增殖性疾病,在我国的发病率约为0.36/10万,占各种类别白血病的20%左右。目前治疗方法以干扰素、骨髓移植、酪氨酸激酶抑制剂为主,仍存在疗效不理想、骨髓来源受限、治疗费用昂贵、耐药性等问题。从祖国医学宝库中寻找出既可以抑制白血病细胞恶性增殖、诱导其凋亡,副作用又相对小、价格便宜的天然药物已成为白血病治疗的新希望和重要途径。近几年来,我国学者积极的探索中药治疗肿瘤的方法,现已发现数十种具有抗肿瘤作用的中药成分。青蒿素就是由我国科学工作者从菊科植物黄花蒿中所提取出来的,也是由我国学者自行研发的新型抗疟药物。在此基础上,我国学者又研发出了多种青篙素类衍生物,包括蒿甲醚、双氢青蒿素、青蒿琥酯等,由于其抗疟活性高,而且毒性小,迅速在疟疾的治疗领域得到了广泛的应用。并且随着研究的不断深入,研究者发现青篙素及其衍生物具有显著的抗肿瘤活性。青蒿素及其衍生物不仅对耐药的疟原虫有效,对耐药的肿瘤细胞也有效,而且具有毒副作用小、患者易耐受等优点,其另一显著的特点就是与传统的化疗药物不存在交叉耐药,这就为研究开发经济、有效的抗肿瘤药物提供了新的线索。本研究以K562细胞系为研究对象,观察不同浓度的青蒿素衍生物青蒿琥酯对K562细胞的增殖抑制及促凋亡作用,并对其在调节Bcl-2蛋白家族方面的作用机制进行初步探讨。方法:1细胞培养:K562细胞常规用RPMI 1640培养液培养。培养液内含10%胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。置于37℃、5%CO2饱和环境下培养、传代,细胞呈70%~80%融合状态后换液。待细胞进入对数生长期后进行相关实验。2细胞增殖抑制实验:收集终浓度为0μg/ml、4μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的青蒿琥酯干预48h后的K562细胞,MTT实验检验增殖抑制。并根据下述公式计算增殖抑制率:抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。3 AnnexinV/PI双染检测细胞凋亡率:收集终浓度为0μg/ml、4μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的青蒿琥酯干预48h后的K562细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率。4流式细胞术检测细胞周期分布:取对数生长期K562细胞,加入终浓度为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的青蒿琥酯处理K562细胞,48h后收集细胞,流式细胞仪测定细胞周期分布,计算细胞周期变化。5 Western blotting检测Bcl-2、Bax、Bcl-rambo、Caspase-3、Survivin蛋白表达水平:收集终浓度为0μg/ml、4μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的青蒿琥酯干预48h后的K562细胞,Western blotting检测上述蛋白的表达水平。结果:1青蒿琥酯对K562细胞产生增殖抑制作用,并呈现剂量依赖性,不同浓度的青蒿琥酯处理组间的A值相比较,P<0.05。随着浓度的增加,青蒿琥脂对K562细胞的增殖抑制率由54.29%增加到77.98%。2青蒿琥酯对K562细胞凋亡的影响:AnnexinV/PI双染检测法检测细胞凋亡率结果显示,终浓度分别为0μg/ml、4μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的青蒿琥酯作用于K562细胞48h后,细胞凋亡率增加,并呈剂量依赖性增加。青蒿琥酯诱导K562细胞凋亡的作用在终浓度为40μg/ml时最明显,凋亡率可达49.47±5.08%,明显高于对照组(P<0.05)。3青蒿琥酯对K562细胞周期分布的影响:终浓度分别为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的青蒿琥酯作用于K562细胞48小时后,流式细胞仪检测细胞周期变化的结果显示,随着青蒿琥酯浓度的增加,K562细胞G2/M期比例逐渐增加(P<0.05),G0/G1+S期比例逐渐减少(P<0.05)。4 Western blotting显示,随着ART作用剂量的增大,Bcl-2蛋白的表达水平呈上升趋势(P<0.05);Bax蛋白的表达水平呈上升趋势(P<0.05);Bcl-rambo蛋白的表达水平呈上升趋势(P<0.05);Caspase-3蛋白的表达水平呈上升趋势(P<0.05),提示细胞凋亡增加;Survivin蛋白的表达水平呈下降趋势(P<0.05)。结论:青蒿琥酯对K562细胞有显著的抑制增殖和诱导凋亡作用,其作用机制可能与启动Bcl-2蛋白家族的促凋亡活性和激活Caspase途径有关。体外研究显示,青蒿琥酯是一种潜在的抗白血病药物。

青蒿琥酯对K562细胞系增殖、凋亡的影响及其机制研究

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