学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

TAT-血红素氧合酶-1融合蛋白对大鼠原位肝移植肝细胞凋亡的影响

作　者: 杜雪芳
导　师: 赵砚丽
学　校: 河北医科大学
专　业: 麻醉学
关键词: 基因产物,tat 蛋白转导 血红素氧合酶-1 肝移植 凋亡 Caspase-3
分类号: R657.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 26次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


目的:肝脏缺血再灌注损伤导致的移植肝脏功能衰竭或早期无功能是原位肝脏移植术后的严重并发症。研究表明,肝细胞凋亡是肝脏缺血再灌注损伤的重要机制之一。有研究报道,通过运用药物、器官缺血预处理、热休克等诱导血红素氧合酶-1(HO-1,热休克蛋白32)高表达,可以减轻器官的缺血再灌注损伤。HO-1是机体血红素分解代谢过程中的限速酶,催化血红素氧化分解产生一氧化碳(CO)、胆绿素和Fe2+,具有抗凋亡、抗氧化损伤、减轻炎症反应等作用,在器官保护方面引起了国内外学者的广泛关注。蛋白结构转导域(PTDs)是一小段不依赖于传统的受体或细胞吞噬作用、可以自由地穿过生物膜的肽链,蛋白质或多肽与PTDs相连后可进入细胞内保持其活性并发挥其生物功能。其中,包含11氨基酸(肽序列:YGRKKRRQRRR)的HIV反式激活蛋白(TAT)是目前研究最广泛的蛋白结构转导域。有研究证实,TAT与HO-1的融合蛋白(TAT-HO-1)可以在大鼠心脏冷保存期成功转导进入心肌细胞并保持其生物活性,延长心脏冷保存期时间、减轻移植心脏的缺血再灌注损伤。但关于其在肝移植缺血再灌注损伤中作用的研究鲜有报道。本研究前期实验证实,TAT-HO-1融合蛋白可以有效转导进入离体培养的L-02细胞及在体大鼠肝脏细胞、在冷保存期可转导进入大鼠肝脏并减轻肝实质细胞和肝窦内皮细胞(SECs)凋亡,对肝功能有一定的保护作用。本研究探讨TAT与HO-1融合蛋白能否转导入大鼠原位肝移植肝细胞,以及对移植肝脏功能和细胞凋亡情况的影响。方法:将HO-1 cDNA编码区与合成的TAT-PTD片断连接到原核表达载体pET32a上,构建TAT-HO-1-pET32a质粒,经测序鉴定后,转化E.coli BL-21(DE3)菌株,IPTG诱导表达、Ni-NTA-agarose(Novagen公司,德国)纯化,Western blot法对TAT-HO-1进行定性分析,化学法检测TAT-HO-1活性,证实所得蛋白为有活性的TAT-HO-1融合蛋白(1mg/ml)后进行动物实验。健康成年雄性SD大鼠,体重250~280g,按随机数字表随机分为供体组和受体组。将受体大鼠随机分为2组(n=24):对照组(C组)和蛋白组(P组)。参照Kamada等的二袖套法建立大鼠原位肝移植模型。C组和P组分别于肝移植术毕经阴茎背静脉注射生理盐水10ml/kg、TAT-HO-1融合蛋白10ml/kg(10mg/kg)。两组分别于分离肝脏血管及周围韧带完毕切取肝脏前即刻(T0)、肝脏移植术后1h (T1)、6h (T2)和12h (T3)时各随机选取6只大鼠,乙醚麻醉后开腹经腹主动脉采血3ml分离血清,并切取肝组织标本立即液氮冷冻,血清与肝组织均置于-80℃冰箱保存。应用免疫组化染色法检测肝脏组织HO-1含量,分析TAT-HO-1转导进入肝脏的情况。全自动生化分析仪测定血清ALT水平,放射免疫分析法检测血清HA水平。原位末端脱氧核苷酸转移酶标记(TUNEL)法分别检测肝实质细胞和SECs凋亡情况,荧光实时定量PCR法(RT-PCR)检测caspase-3 mRNA表达水平。苏木素-伊红(HE)染色,光镜下观察肝组织病理学变化。结果:1肝组织中HO-1含量两组肝脏移植术后1h、6h、12h肝组织中可见明显棕黄色HO-1阳性染色分布;与C组相比,P组肝组织中HO-1含量均高于C组(P<0.05)。2血清ALT和HA水平测定两组各组内血清ALT和HA水平T1~T3时均高于T0时,差异有统计学意义(P<0.05)。与C组比较,P组T0时ALT和HA水平差异无统计学意义(P>0.05),T1~T3时均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3肝实质细胞和SECs凋亡情况与肝组织Caspase-3 mRNA水平两组各组内肝实质细胞和SECs的AI与肝组织Caspase-3 mRNA水平,在T2时高于其余各时点,差异有统计学意义(P<0.05)。与C组比较,P组T0时肝实质细胞和SECs AI与肝组织Caspase-3 mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05),T1~T3时均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。4组织病理学变化肝移植术毕6h, P组可见肝细胞浊肿,肝索轻度增宽,汇管区少量中性粒细胞浸润; C组可见肝细胞浊肿及空泡变性,肝细胞点片状坏死,汇管区中性粒细胞浸润增多。结论:TAT-HO-1融合蛋白在大鼠原位肝移植术后经静脉注射可以转导进入大鼠移植肝脏,可能通过下调Caspase-3 mRNA表达水平,减轻肝实质细胞和SECs凋亡,从而对大鼠肝移植术后的肝脏功能发挥保护作用。蛋白转导技术有望成为减轻肝移植肝脏缺血再灌注损伤的新措施。

全文目录


中文摘要  4-7
英文摘要  7-11
前言  11-12
材料与方法  12-24
结果  24-26
附图  26-34
附表  34-36
讨论  36-39
结论  39-40
参考文献  40-44
综述 肝脏缺血再灌注损伤的细胞凋亡与血红素氧合酶-1作用的研究进展  44-52
  参考文献  48-52
致谢  52-53
个人简历  53

相似论文

  1. 西施舌精子冷冻保存及其冷冻损伤机理研究,S968.3
  2. CADPE抗肿瘤作用及对胃癌细胞凋亡的影响,R735.2
  3. 塞来昔布与β-榄香烯联合给药的抗肿瘤作用及其机制研究,R96
  4. TRAIL对肿瘤侵润CD4~+CD25~+ Treg的调节作用,R730.2
  5. 醋酸铅对鲤鱼卵巢上皮细胞毒性的研究,X174
  6. 地克珠利对柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子甘油醛-3-磷酸脱氢酶的影响,S858.31
  7. PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞钙信号的影响及其机理初探,S858.28
  8. 血管生成调节因子对性成熟小鼠卵泡及其血管发育的影响,S852.2
  9. β-catenin在猪卵巢组织中的表达以及对猪卵巢颗粒细胞凋亡及类固醇生成酶的影响,S828
  10. 伏马菌素B1和黄曲霉毒素B1联合诱导Vero细胞凋亡的研究,S856.9
  11. 黄曲霉毒素B1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导锦鲤原代肝细胞凋亡机制的初步研究,S856.9
  12. 沉默BMPR-IB基因对猪卵巢颗粒细胞凋亡及BMP通路相关基因表达的影响,S828
  13. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇对鸡软骨细胞增殖、分化及凋亡的影响,S858.31
  14. Foxol对小鼠颗粒细胞凋亡的影响,S865.13
  15. 蜂毒素对人肝癌HepG-2细胞株裸鼠移植瘤生长的抑制作用及部分机制研究,R735.7
  16. 骨髓间充质干细胞预移植1周对大鼠心肌缺血再灌损伤的修复作用,R542.22
  17. WWOX在胆管癌组织中的表达及其对胆管癌细胞生物学行为的影响,R735.8
  18. 18氟—氟代脱氧葡萄糖诱导Eca-109食管癌细胞凋亡的初步研究,R735.1
  19. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导仓鼠肾细胞凋亡信号转导机制的研究,S856.9
  20. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导人结肠癌细胞凋亡线粒体信号转导机制的研究,R735.35
  21. 磷脂酶C和D在木聚糖酶诱导的水稻悬浮细胞抗病反应中的作用,S511

中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 外科学各论 > 腹部外科学 > 肝及肝管
© 2012 www.xueweilunwen.com