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shRNA质粒干扰人脐静脉内皮细胞BMP-2蛋白表达的研究

作　者: 阮鸿儒
导　师: 刘流
学　校: 昆明医学院
专　业: 外科学
关键词: hUVECs BMP-2 RNAi 质粒干扰
分类号: R782.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

[背景与目的]颌骨缺损的修复问题一直是临床上难以解决的问题,构建组织工程骨用于缺损部位的移植修复是一项重要的治疗方式。组织工程骨构建方法多用单纯种子细胞接种,虽然能够成骨,但存在诸多弊端,如组织工程骨血管化缓慢,新骨生长迟缓等问题。因此如何在构建组织工程化骨组织的同时,促进小血管的长入以及细胞与支架材料复合物内血供的重建就成为骨组织工程由基础向临床应用的关键性环节。目前多种细胞的联合培养为我们解决这一问题提供了重要的方向。骨形态发生蛋白(BMP)是一组具有类似结构的高度保守的功能蛋白,它们能在体内诱导骨和软骨的形成,并且参与了肿瘤的发生与发展,现研究发现,它们还参与调节许多细胞的增殖、分化和凋亡的生物学过程。我们前期研究发现BMP-2因子是促进血管内皮细胞与骨髓间充质干细胞联合培养体系中种子细胞的增殖和成骨分化的关键因素之一。但BMP-2在联合培养体系中对BMSCs基因表达起什么影响作用还不完全清楚,其中确切机制还待进一步研究。近年来,RNA干扰技术成为基因功能研究强有力的工具,本研究先将人脐静脉内皮细胞进行离体培养,利用RNAi技术封闭该细胞BMP-2基因的表达,检测BMP-2蛋白表达的变化,明确RNA静默效果,为内皮细胞和间充质干细胞在联合培养系统相互影响作用的研究提供实验数据,以期解决组织工程种子细胞在支架材料上增殖、黏附和成骨分化的难题。[方法]选择BMP-2基因表达较高的人脐静脉内皮细胞系为研究对象,取脐带标本采用消化法分离纯化脐静脉内皮细胞并进行离体培养,用Western-blot蛋白检测方法分别检测第4、6、8、10天BMP-2蛋白的表达情况进行验证比较。然后设计四条BMP-2基因的干扰序列,用质粒作为载体包装事先设计好的shRNA,再用优化脂质体法将构建的干扰基因序列转染到细胞中,并采用荧光显微镜观察转染的效果,Western-blot检测BMP-2蛋白的表达。摸索出转染的最佳条件后,取其中筛选出来最有效果的第2号质粒用于转染,并分别在转染后的第1、2、3、4、5、6天收集细胞蛋白,用Western-blot检测法验证转染的最佳时间点。[结果]免疫组化染色证实为人脐静脉内皮细胞,蛋白检测结果显示该细胞能高表达BMP-2蛋白,查找到基因库中BMP-2基因的序列,并根据siRNA设计原则成功构建四种能够表达siRNA的质粒,通过基因测序分析验证插入质粒的核苷酸序列和设计的完全符合。将质粒转染到内皮细胞中,Western-blot检测结果显示2号和3号siRNA转染后的细胞BMP-2蛋白表达较对照内皮细胞表达量明显降低,而其他两组siRNA和siRNA negative组内皮细胞同空白对照组内皮细胞则无明显差异。取2号质粒对内皮细胞进行转染,发现当质粒3ul,脂质体10ul,转染6小时,荧光显微镜下观察转染的效率为60%,改变其中的任意一个数值,转染的效果随之改变。转染后第1天到第4天,BMP-2蛋白表达逐渐递减,第5天后又有所增加。[结论]人脐静脉内皮细胞能高表达BMP-2蛋白,在第8天表达量最高,构建的4条质粒均正确,用2号质粒进行转染效果较好,阳离子脂质体法能高效的将特异性siRNA的质粒载体封闭内皮细胞BMP-2基因的表达,最佳条件下转染效率约为60%。Western-blot检测内皮细胞BMP-2蛋白表达达到RNA静默要求,转染成功的内皮细胞可应用到后期联合培养体系的不同种类细胞的相互影响的研究中。

全文目录

英汉缩略语名词对照  5-6
摘要  6-8
Abstract  8-11
前言  11-13
材料与方法  13-26
结果  26-34
讨论  34-40
结论  40-41
参考文献  41-46
综述  46-55
  参考文献  53-55
发表论文和参加科研情况说明  55-56
致谢  56

shRNA质粒干扰人脐静脉内皮细胞BMP-2蛋白表达的研究

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