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空间环境诱发小麦突变体的TILLING分析

作　者: 潘娜
导　师: 刘录祥
学　校: 中国农业科学院
专　业: 作物遗传育种
关键词: 小麦 空间诱变 TILLING 点突变 片段缺失
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


TILLING技术目前已成功应用于植物化学诱变群体突变位点筛选并取得了良好的研究进展。本研究旨在探索TILLING在小麦空间环境诱变群体中应用的可行性。以冬小麦品种新麦18空间诱变SP2代群体为试验材料,探索建立基于CELⅠ酶切的高通量TILLING筛选体系,检测小麦品质、抗逆及抗病等性状相关的目标基因片段,并结合PCR技术检测小麦Lr34基因大片段缺失突变。主要研究结果如下:1、在TILLING技术体系建立与优化过程中,通过提高基因组DNA提取中样品研磨频率及延长KAc溶液的反应时间、调整PCR反应体系中dNTP、Mg2+及引物浓度、超纯水代替CELⅠ缓冲液、提高空气相对湿度至40%等,在小麦中建立起了稳定的基于CELⅠ酶切的高通量TILLING技术检测平台。2、在2304个SP2代单株中对Pinb、DREB1及Lr34基因的5个目的片段进行筛选,在Pinb基因与小麦A基因组上的DREB1基因片段中检测到了突变位点,突变频率分别为1/3073 Kb与1/1713 Kb;另外3个目标片段没有检测到等位变异位点。Pinb基因中检测到1个突变体P679,为碱基A缺失突变,经表型鉴定后发现,该缺失突变引起了突变体P679的种子硬度提高;在A基因组上的DREB1基因中共检测到2个突变体D49和D157,其中D49产生碱基T缺失,D157除了发生T碱基缺失同时产生碱基T到碱基C的转换,均导致了蛋白编码的提前终止。3、在新麦18 SP2代群体2304个样本中,共检测到12个样本发生Lr34基因片段缺失突变。突变验证结果表明,在相同的PCR扩增及检测条件下,新麦18野生型样本均能扩增出目的基因片段,而突变样本不能扩增出目的条带,缺失片段大小约为6Kb,突变频率为0.52%。以上试验结果证实,TILLING技术可以应用于空间诱变群体突变检测。空间诱变群体点突变频率总体上低于EMS化学诱变,PCR技术检测大片段缺失突变结果表明,空间诱变群体中片段缺失突变频率相对较高,且空间诱变可引起大片段缺失突变。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-11
第一章 绪论  11-20
  1.1 研究目的与意义  11-12
  1.2 TILLING 技术原理及特点  12-14
    1.2.1 TILLING 技术基本原理  12-13
    1.2.2 TILLING 技术特点  13-14
  1.3 国内外TILLING 技术的应用现状  14-16
    1.3.1 在小麦中的应用  14
    1.3.2 在水稻中的应用  14-15
    1.3.3 在玉米中的应用  15
    1.3.4 在大豆中的应用  15
    1.3.5 在自然资源分析中EcoTILLING 的应用  15-16
  1.4 TILLING 技术改进研究  16-18
    1.4.1 TILLING 分析群体的构建  16
    1.4.2 DNA 建池策略  16-17
    1.4.3 突变位点鉴定  17-18
  1.5 TILLING 技术发展趋势与前景  18
  1.6 研究内容与目标  18-20
第二章 基于CELⅠ酶切的小麦TILLING 体系建立与优化  20-30
  2.1 试验材料  20
  2.2 试验方法  20-24
    2.2.1 基因组DNA 的提取  20-21
    2.2.2 DNA 浓度测定及DNA 池的构建  21
    2.2.3 目的基因片段PCR 扩增  21-22
    2.2.4 酶切反应  22-23
    2.2.5 样品纯化及浓缩  23
    2.2.6 凝胶制备及电泳  23-24
    2.2.7 图像分析  24
  2.3 结果与分析  24-29
    2.3.1 基因组DNA 提取方法的改进  24-25
    2.3.2 DNA 浓度  25
    2.3.3 PCR 扩增体系的优化  25-27
    2.3.4 酶切反应体系及产物纯化的改进  27-29
  2.4 小结  29-30
第三章 小麦品质与抗逆性状目标基因的TILLING 分析  30-36
  3.1 试验材料  30
    3.1.1 种子材料  30
    3.1.2 目标基因  30
  3.2 试验方法  30-32
    3.2.1 引物设计及引物序列  30
    3.2.2 引物合成  30-31
    3.2.3 特异性引物筛选  31
    3.2.4 目的基因突变位点检测  31
    3.2.5 图像分析  31
    3.2.6 DNA 序列分析  31
    3.2.7 点突变频率  31
    3.2.8 种子硬度测定  31-32
  3.3 结果与分析  32-35
    3.3.1 小麦硬质基因Pinb  32-34
    3.3.2 小麦抗逆转录因子DREB1  34
    3.3.3 小麦慢锈基因Lr34  34-35
  3.4 小结  35-36
第四章 基于PCR 扩增的小麦LR34 基因大片段缺失检测  36-39
  4.1 试验材料与方法  36-37
    4.1.1 试验材料  36
    4.1.2 引物设计  36
    4.1.3 Lr34 基因大片段缺失检测  36
    4.1.4 大片段缺失验证  36-37
    4.1.5 大片段缺失突变频率  37
  4.2 结果与分析  37-38
  4.3 小结  38-39
第五章 讨论与结论  39-43
  5.1 讨论  39-42
    5.1.1 TILLING 检测平台的建立与优化  39-41
    5.1.2 空间诱变点突变频率与突变类型  41
    5.1.3 空间诱变大片段缺失突变频率  41-42
  5.2 结论  42-43
参考文献  43-48
致谢  48-49
作者简历  49

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 麦 > 小麦
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