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重组H3N2亚型猪流感灭活疫苗及合成肽疫苗的初步研究

作　者: 马继红
导　师: 童光志
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 荧光定量PCR H3N2猪流感重组灭活疫苗合成肽疫苗
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

猪流感(Swine Influenza, SI)是由猪流感病毒(Swine Influenza Virus,SIV)引起的一种急性、高度接触传播的猪呼吸道传染病,可引起病猪出现体温增高、食欲不振、呼吸困难、咳嗽、流产、延迟出栏等症状,严重危害着世界养猪业。猪的呼吸道上皮细胞同时具有禽流感病毒和人流感病毒的受体,被认为是流感病毒由“禽-人”传播的重要中间宿主和新流行毒株产生的“孵育器”,而2009年甲型H1N1流感的大流行进一步证实了SIV的重要公共卫生学意义。目前防控猪流感最有效的方法是免疫接种,但现有疫苗存在抗原变异频繁、交叉保护力不强的问题。本研究通过反向遗传技术获得鸡胚繁殖力较强的重组H3N2病毒,制备灭活疫苗并在小鼠上评价其免疫原性和保护效力。此外,还将重组H3N2灭活疫苗与M2e分支肽疫苗共同免疫小鼠,发现M2e分支肽显著增强了重组灭活疫苗的交叉保护能力,研究主要从以下方面开展:本研究根据A型流感病毒基质蛋白(matrix protein, M)基因保守序列设计并合成特异性引物和TaqMan BHQ探针,利用实时荧光定量RT-PCR技术建立A型流感病毒的快速检测方法。该方法敏感性、特异性和重复性良好,对40份实验感染样品的检测结果表明,与常规RT-PCR检测方法相比,该方法灵敏度更高,特异性更强。此方法可应用于流感病毒的监测和致病机理的研究。流感病毒M2蛋白N端的23个氨基酸(M2e)非常保守,是研究具有广谱交叉保护能力的“通用疫苗”的理想靶标。本研究将4个拷贝的M2e通过赖氨酸与通用Th细胞表位偶联获得M2e分支肽(M2e-MAP),添加弗氏佐剂免疫小鼠,结果显示:其能诱导高水平的M2e特异性IgG抗体,能有效限制PR8(H1N1)、SwGD96(H1N1)和SwHLJ1(H3N2)病毒在肺脏中的复制,减轻肺脏病理变化,针对致死剂量的PR8(H1N1)病毒的攻击,M2e-MAP+Freund疫苗免疫能显著缓解小鼠食欲减退、发热、颤栗等临床症状,并提供有效的免疫保护(保护率达100%)。上述结果给未来通用疫苗的研究提供了一定参考。H3N2亚型SIV在世界猪群中广泛流行,本研究利用反向遗传技术获得了鸡胚繁殖力较强的重组H3N2(rgH3N2)病毒,其HA和NA基因来源于H3N2病毒,其它六个内部基因来源PR8毒株,制备灭活疫苗并在小鼠上评价其免疫原性和保护效力。此外,本研究还将重组灭活疫苗与M2e分支肽共同免疫小鼠。结果显示:重组H3N2灭活疫苗免疫可刺激小鼠产生高滴度的HI抗体和中和抗体,并能有效限制病毒在肺脏内的复制,对H3N2病毒的攻击能够提供100%的保护,但其对异源病毒的交叉保护力较差;而添加M2e分支肽共同免疫能够诱导小鼠产生高水平的HI抗体、中和抗体(与重组灭活疫苗单独免疫水平相当)及rgH3N2和M2e分支肽特异性的IgG抗体;M2e分支肽的添加显著增强了重组灭活疫苗对异源病毒的免疫保护作用,能有效限制SwGD96(H1N1)和PR8(H1N1)病毒在肺脏内的复制并减轻肺脏的病理变化,对PR8(H1N1)病毒的致死性攻击可提供有效的免疫保护(保护率达100%)。鉴于以上结果,我们认为将M2e分支肽加入灭活疫苗共同免疫可以作为未来流感疫苗研发的参考思路。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-14
第一章引言  14-24
  1.1 猪流感概述  14-15
  1.2 SIV 分子生物学  15-17
    1.2.1 SIV 的形态结构  15-16
    1.2.2 SIV 基因组结构和功能  16
    1.2.3 SIV 的复制  16-17
  1.3 猪流感疫苗研究进展  17-19
    1.3.1 全病毒灭活苗  17-18
    1.3.2 弱毒活疫苗  18
    1.3.3 亚单位疫苗  18-19
    1.3.4 病毒活载体疫苗  19
  1.4 通用型流感疫苗研究进展  19-23
    1.4.1 基于 M2e 的通用型流感疫苗  19-21
    1.4.2 基于 HA 的通用型流感疫苗  21-22
    1.4.3 基于 NP 的通用型流感疫苗  22-23
  1.5 研究目的与意义  23-24
第二章 A 型流感病毒 TAQMAN 实时荧光定量 RT-PCR 快速检测方法的建立  24-34
  2.1 材料与方法  25
    2.1.1 毒株与核酸样品  25
    2.1.2 试剂与仪器  25
  2.2 方法  25-27
    2.2.1 引物设计与合成  25
    2.2.2 病毒 RNA 的提取  25-26
    2.2.3 cDNA 合成  26
    2.2.4 阳性标准模板的制备  26
    2.2.5 标准曲线的绘制  26-27
    2.2.6 特异性试验  27
    2.2.7 敏感性试验  27
    2.2.8 重复性试验  27
    2.2.9 实验室感染样品的检测  27
  2.3 结果  27-32
    2.3.1 阳性标准模板的制备  27-28
    2.3.2 标准曲线的绘制  28-29
    2.3.3 特异性试验结果  29
    2.3.4 敏感性试验结果  29-30
    2.3.5 重复性试验结果  30-31
    2.3.6 实验室感染样品的检测结果  31-32
  2.4 讨论  32-34
第三章 M2E 合成肽疫苗的研究  34-45
  3.1 材料  35
    3.1.1 毒株  35
    3.1.2 实验动物  35
    3.1.3 主要试剂和仪器  35
  3.2 方法  35-37
    3.2.1 M2e 合成肽  35-36
    3.2.2 免疫和攻毒  36
    3.2.3 ELISA  36
    3.2.4 肺脏病毒滴度测定  36-37
    3.2.5 组织病理学观察  37
    3.2.6 体重变化和保护率  37
    3.2.7 统计学分析  37
  3.3 结果  37-43
    3.3.1 M2e 分支肽诱导高水平的特异性抗体  37-38
    3.3.2 M2e 分支肽免疫能够限制病毒复制并减轻肺脏病变  38-41
    3.3.3 体重变化和保护率  41-43
  3.4 讨论  43-45
第四章重组 H3N2 亚型猪流感灭活疫苗和 M2E 合成肽共同免疫可对小鼠提供异源保护作用  45-63
  4.1 材料  45-46
    4.1.1 毒株、菌株与载体  45
    4.1.2 鸡胚和实验动物  45-46
    4.1.3 主要试剂和仪器  46
  4.2 方法  46-52
    4.2.1 重组 H3N2 病毒的获得  46-49
    4.2.2 免疫原的制备  49-50
    4.2.3 动物实验  50
    4.2.4 ELISA  50-51
    4.2.5 HI 和 NT  51
    4.2.6 肺脏病毒滴度测定  51
    4.2.7 组织病理学观察  51
    4.2.8 体重变化和保护率  51
    4.2.9 统计学分析  51-52
  4.3 结果  52-62
    4.3.1 重组病毒的获得  52-53
    4.3.2 免疫刺激小鼠产生高滴度的特异性抗体  53-55
    4.3.3 免疫刺激小鼠产生 HI 抗体和中和抗体  55
    4.3.4 共同免疫能够限制病毒复制并减轻肺脏病变  55-60
    4.3.5 体重变化和保护率  60-62
  4.4 讨论  62-63
第五章全文结论  63-64
参考文献  64-74
致谢  74-75
作者简历  75

重组H3N2亚型猪流感灭活疫苗及合成肽疫苗的初步研究

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