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基于微生物降解菌群的海洋溢油生物修复技术研究

作　者: 李倩
导　师: 赵爱芬；郑立
学　校: 鲁东大学
专　业: 生态学
关键词: 海洋溢油生物修复新种鉴定菌群构建溢油模拟实验生物修复菌剂
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

从海洋沉积物样品中筛选到42株以石油烃为唯一碳源和能源的细菌。采用多种分类学方法对潜在的石油烃降解菌新种进行了鉴定,发现菌株PY97S为海杆菌属(Marinobacter sp.)的一个新种。对该菌株的石油烃利用情况进行了初步分析,结果显示它能够降解11种PAHs;GC-MS分析结果显示该菌株对初始浓度为0.2 g/L的典型PAHs菲在10 d后的降解率可达到99%。根据功能互补的原则构建了三个三元菌群,采用GC-MS、重量法等检验其对石油的降解效果。结果发现,在营养培养基+原油环境中,DC10中各单菌之间协同效应最显著,15d对初始浓度为0.1g/L的原油降解率达到82.47%,相对于对照及其组成单菌均有显著提高。进一步考察了营养盐条件对菌群DC10石油降解效果的影响。结果显示,在陈海水+原油的培养基中,当N、P浓度分别为100mg/L、10mg/L时,营养盐对菌群的石油降解率提高最明显,15d对初始浓度为0.1g/L的原油降解率达到53.46%,比不添加营养盐的处理提高了26.72%。将构成降解菌群DC10的各单菌分别发酵培养,以细胞数1:1:1的比例配制溢油修复菌剂。为检验菌剂的石油修复效果以将其进一步应用到实际海洋溢油事故的处置中,分别设计了室内模拟岸滩溢油修复实验和室外模拟岸滩溢油修复实验。在室内模拟实验中,设置了6种不同处理,采用GC-MS等对降解效果进行评价。结果显示,21d后“降解菌群+营养盐”的处理对总石油烷烃和总烷基化多环芳烃降解率最高,分别为58.09%和48.92%,与阴性对照相比分别提高了44.09%和29.57%。在室外模拟岸滩溢油修复实验中,采用GC-MS、紫外分光光度法等对降解效果进行综合评价。根据降解率n-C17/Pr和n-C18/Ph计算,“菌剂+缓释肥”处理的降解率分别达到75.65%和78.28%,“菌剂+水溶性营养盐”的处理的降解率分别为43.47%和45.07%,阴性对照的降解率分别为18.77%和18.67%。说明在模拟现场条件下添加缓释肥的溢油修复效果优于添加水溶性营养盐的处理效果。以上结果对于溢油修复菌剂及其复配营养盐在实际溢油事故应急处置中的应用奠定了良好的基础。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-12
第一章前言  12-19
  1.1 海洋石油污染现状及危害  12-15
    1.1.1 石油污染物  12-13
    1.1.2 石油污染现状  13-14
    1.1.3 石油污染的危害  14-15
      1.1.3.1 海洋石油污染生态危害  14-15
      1.1.3.2 海洋石油污染社会危害  15
  1.2 海洋石油污染的原因  15-16
  1.3 海洋石油污染处理方法及生物修复技术  16-17
    1.3.1 海洋石油污染处理方法  16
    1.3.2 生物修复技术  16-17
    1.3.3 海洋环境中微生物对石油烃的降解  17
  1.4 本文的研究目的及意义  17-19
第二章海洋石油烃降解菌的筛选和鉴定  19-43
  2.1 前言  19
  2.2 实验材料和仪器  19-23
    2.2.1 菌株来源  19-20
      2.2.1.1 环境样品  19-20
      2.2.1.2 实验菌株  20
    2.2.2 药品与试剂  20-21
    2.2.3 常用溶液与培养基  21-22
    2.2.4 实验仪器与软件  22-23
  2.3 实验方法  23-29
    2.3.1 石油烃降解菌群的筛选、富集和单菌的分离  23
    2.3.2 菌落形态描述及电子显微镜观察  23-24
    2.3.3 生理生化特征  24-25
      2.3.3.1 革兰氏染色  24
      2.3.3.2 接触酶和氧化酶特性实验  24-25
      2.3.3.3 菌株培养特征分析  25
      2.3.3.4 菌株抗性实验  25
    2.3.4 HPLC 法测定菌株基因组DNA G+C 含量  25
    2.3.5 全细胞脂肪酸含量的测定  25-26
    2.3.6 Biolog 碳源利用测试  26
    2.3.7 菌株呼吸醌的测定  26-27
    2.3.8 DNA 杂交实验  27-28
      2.3.8.1 细菌基因组DNA 提取  27
      2.3.8.2 DNA 杂交试剂盒  27-28
    2.3.9 菌株降解能力初探  28
    2.3.10 基于16S rRNA 基因的系统发育学分析  28-29
      2.3.10.1 16S rRNA 基因的 PCR 扩增  28
      2.3.10.2 PCR扩增产物纯化  28-29
      2.3.10.3 系统发育学分析  29
  2.4 实验结果  29-40
    2.4.1 石油烃降解菌的筛选  29-33
    2.4.2 菌落描述及透射电镜结果  33-34
    2.4.3 生理生化特征  34-37
      2.4.3.1 菌株PY97S 的基本生化特征  34
      2.4.3.2 菌株PY97S 的培养特征  34-36
        2.4.3.2.1 生长温度范围  34-35
        2.4.3.2.2 NaCl 生长浓度范围  35-36
        2.4.3.2.3 培养基初始pH 对菌株生长的影响  36
      2.4.3.3 菌株抗性实验结果  36-37
    2.4.4 DNA G+C 含量和DNA 杂交实验结果  37
    2.4.5 呼吸醌的测定和细胞脂肪酸组成测定结果  37
    2.4.6 Biolog 板碳源利用情况  37-39
    2.4.7 菌株PY97S 对烷烃的降解实验结果  39
    2.4.8 系统发育学分析  39-40
  2.5 与近缘模式株的比较  40-42
  2.6 小结  42-43
第三章石油降解菌群的构建  43-59
  3.1 前言  43
  3.2 实验材料和仪器  43-45
    3.2.1 实验材料和用品  43-45
    3.2.2 实验仪器  45
  3.3 实验方法  45-48
    3.3.1 菌群构建  45-46
    3.3.2 样品前处理及评价方法  46-47
      3.3.2.1 样品前处理  46-47
      3.3.2.2 评价方法-半定量法  47
    3.3.3 菌群降解石油营养盐条件优化实验  47-48
  3.4 实验结果  48-57
    3.4.1 构建菌群石油降解效果评价  48-56
      3.4.1.1 重量法分析不同菌株对石油的降解率  48-49
      3.4.1.2 生物降解后石油中烷烃组分变化分析  49-52
      3.4.1.3 生物降解后石油中芳香烃组分的变化  52-56
    3.4.2 菌群降解石油营养盐条件优化实验  56-57
  3.5 小结  57-59
第四章室内模拟实验及效果评价  59-71
  4.1 前言  59-60
  4.2 实验材料和仪器  60-61
    4.2.1 实验材料  60
    4.2.2 仪器  60-61
  4.3 实验方法  61-64
    4.3.1 菌株的单种发酵  61-62
    4.3.2 建立室内模拟系统  62-63
    4.3.3 室内模拟实验操作步骤  63-64
    4.3.4 建立评价体系  64
  4.4 实验结果  64-70
    4.4.1 室内模拟岸滩溢油生物修复实验图片资料及表观结果  64-66
    4.4.2 室内模拟岸滩溢油生物修复实验中总石油烷烃随时间的变化趋势  66-68
    4.4.3 室内模拟岸滩溢油生物修复实验中总烷基化芳香烃的变化趋势  68-70
  4.5 小结  70-71
第五章天津溢油生物修复现场实验及效果评价  71-82
  5.1 前言  71-72
  5.2 实验方法  72-76
    5.2.1 实验试剂和仪器  72-73
    5.2.2 实验设计  73-74
    5.2.3 现场实验操作和采样方法  74-75
    5.2.4 原油降解效果评价方法  75-76
  5.3 实验结果  76-81
    5.3.1 现场实验图片资料及表观结果  76-78
    5.3.2 营养盐添加结果  78
    5.3.3 GC-MS 测定沉积物石油中烃类降解率变化  78-80
    5.3.4 紫外分光光度法对海水中的石油烃进行定量分析  80-81
  5.4 小结  81-82
第六章总结和展望  82-84
参考文献  84-91
致谢  91-92
攻读硕士期间取得的科研成果  92

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