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长春花叶片三种生物碱含量及合成基因表达的初步研究

作　者: 田跃胜
导　师: 赵静雅
学　校: 上海交通大学
专　业: 植物学
关键词: 长春花萜类吲哚生物碱荧光定量PCR 高压液相色谱香叶醇10-脱羧酶(G1OH) 色胺酸脱羧酶(TDC) 异胡豆苷合成酶(STR) 4-O-去乙酸基文多灵4-O-酰基转移酶(DAT) Ⅲ型过氧化物酶(PRXl) 开环马钱子甙合酶(SLS)
分类号: R286
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

文多灵(Vindoline)、长春质碱(Catharanthine)、长春碱(Vinblastine)三种生物碱产于药用植物长春花,具有抗肿瘤作用,但这些TIAs在天然长春花植株中含量较低并且分布具有组织和生长阶段的特异性,不能满足市场需求,使其价格较为昂贵。利用代谢工程在长春花中过量表达TIAs生物合成途径中的关键酶基因,为提高植物生物碱含量和改变生物碱组成成份开辟了新的途径。然而长春花(Catharanthus roseus L. G. Don)萜类吲哚生物碱(Terpenoid indole alkaloids, TIAs)的生物合成途径十分复杂,包含了多个关键酶和转录因子。目前已有30多个催化酶和转录因子基因被克隆。因此探明长春花叶片中生物碱的动态变化规律和生物碱合成途径中的关键酶和转录因子的表达量是十分必要的。本研究以长春花叶片为研究材料,利用高效液相色谱技术研究了长春花叶片中生物碱的变化,利用荧光定量PCR技术检测了长春花叶片中生物碱合成途径中11个相关基因的相对表达量。得出了以下结果：1.探明了长春花叶片中三种生物碱的动态变化规律长春花吲哚生物碱文多灵、长春碱、长春质碱的分布具有组织器官和生长发育的特异性。其中,不同时期长春花三种叶片形态中文多灵含量的差异较大,最高含量为1.18 mg/g,最低含量为0.02 mg/g,相差大约60倍左右。长春碱的最高含量为最低含量的四倍,为0.01 mg/g-0.04 mg/g。长春碱在长春花叶片中的含量比较低,最高含量只有万分之四。长春质碱的含量为0.4 mg/g-1.16 mg/g,大约相差2.5倍。长春花吲哚生物碱文多灵、长春碱、长春质碱的组织特异性具有一定的规律性。三种叶片形态中的吲哚生物碱文多灵,长春质碱含量呈现规律性变化,在幼嫩叶片(L1)中最高,在成熟的叶片(L3)中的含量最低。两种生物碱,在前五个生长时期,L1和L2叶片状态的含量相差不到一倍,而L3状态叶片的两种生物碱含量和前两种状态叶片的生物碱含量相比差异比较大,最大到2.5倍。长春碱的含量大部分呈现L3>L2>L1的规律,叶片的L1和L2状态的叶片的长春碱含量相差不大,长春碱在长春花叶片中的含量比较低,最高含量只有万分之四。长春花用于生物碱检测的叶片的最佳采集期在花蕾期到开花期。三种生长状态的长春花叶片的吲哚生物碱文多灵的含量为0.75 mg/g,长春质碱的含量为0.83 mg/g,成熟期2的三种生长状态的长春花叶片的吲哚生物碱长春碱的含量为0.027 mg/g,花蕾期,五对真叶生长期,开花期生物碱总含量较大,以长春花叶片的生物量最大为依据,从花蕾期到开花期为最佳的采收期。2.比较了长春花叶片中生物碱合成途径的11个合成酶基因的相对表达量依照长春花悬浮细胞和毛状根中与生物碱含量相关性大的关键酶基因数据,选取长春花生物碱合成途径中的11个关键酶基因(ASA、CPR、D4H、TDC、GGPP、STR、ORCA3、G10H、PRX、SLS、DAT)。利用定量PCR检测了这些基因的相对表达量,发现环烯醚萜苷途径中的GGPP基因、G10H基因、SLS基因三个基因的表达可促进裂环马钱子苷的合成,STR基因的表达量增加可使生物碱长春质碱的含量提高,D4H基因,DAT基因的表达可促进文多灵的生成。文多灵和长春质碱在PRX基因编码的蛋白的催化下可促进长春碱的合成。而莽草酸途径中的ASA基因、TDC基因对叶片中生物碱的增加没有明显的促进作用。ORCA3基因的表达具有时空性,在嫩叶片中的表达量较高,在长春花成熟期的表达量较高。对D4H、DAT、SLS、TDC基因的表达具有正调控作用。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-13
第一章文献综述  13-32
  1.1 长春花及其种植  13-15
    1.1.1 长春花的生物学特性  13
    1.1.2 栽培管理  13-14
    1.1.3 病虫害防治  14-15
  1.2 长春花生物碱的合成途径  15-21
    1.2.1 类萜途径  16-20
    1.2.2 吲哚途径  20-21
  1.3 TIAs的生物合成  21-23
  1.4 长春花生物碱合成途径中的关键酶及调控因子的研究进展  23-28
    1.4.1 羟甲基戊二酰CoA还原酶  23
    1.4.2 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶  23-24
    1.4.3 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶  24
    1.4.4 香叶基香叶基焦磷酸合成酶  24
    1.4.5 香叶醇合酶  24-25
    1.4.6 香叶醇-10-脱氢酶  25
    1.4.7 开环马钱子甙合酶  25
    1.4.8 邻氨基苯甲酸合成酶  25-26
    1.4.9 色氨酸脱羧酶  26
    1.4.10 异胡豆苷合成酶  26
    1.4.11 异胡豆苷葡萄糖苷酶  26-27
    1.4.12 它宁波羟化酶  27
    1.4.13 去乙酰文多灵-4-脱羧酶  27
    1.4.14 脱乙酰文多灵-4-O-乙酰转移酶  27-28
    1.4.15 脱水长春碱合酶  28
  1.5 长春花吲哚生物碱合成途径中的转录因子  28-31
    1.5.1 ORCA家族  28-29
    1.5.2 其他几个重要的转录因子  29-31
  1.6 本研究的目的和意义  31-32
第二章不同时期长春花叶片吲哚生物碱含量的测定  32-46
  2.1 引言  32-33
  2.2 材料与试剂  33-36
    2.2.1 植物材料及无菌苗的培养  33
    2.2.2 仪器设备和试验试剂  33-36
      2.2.2.1 试剂盒及购买的试剂  34
      2.2.2.2 常用试剂及培养基的制备  34-35
      2.2.2.3 主要仪器设备  35-36
  2.3 生物碱测定方法  36-37
    2.3.1 材料准备和处理  36
    2.3.2 标准溶液的配制  36
    2.3.3 流动相的选择  36
    2.3.4 标准曲线的制作  36-37
  2.4 试验方案  37-38
  2.5 结果与分析  38-43
    2.5.1 不同时期长春花三种叶片形态中文多灵含量的比较  38-39
    2.5.2 不同时期长春花三种叶片形态中长春碱含量的比较  39-40
    2.5.3 不同时期长春花三种叶片形态中长春质碱含量的比较  40
    2.5.4 同一形态长春花叶片在不同时期文多灵含量的比较  40-41
    2.2.5 同一形态长春花叶片在不同时期长春质碱含量的比较  41-42
    2.5.6 同一形态长春花叶片在不同时期长春碱含量的比较  42-43
    2.5.7 同一形态长春花叶片在不同时期生物碱总含量的比较  43
  2.6 小结  43-46
第三章长春花不同时期叶片中生物碱合成途径中的关键酶基因的表达的测定  46-62
  3.1 引言  46-47
  3.2 材料与试剂  47
    3.2.1 植物材料及无菌苗的培养  47
    3.2.2 仪器设备和试验试剂  47
  3.3 长春花生物合成途径中11个关键酶基因在不同叶片不同时期的表达  47-54
    3.3.1 引物的设计  47-49
    3.3.2 长春花总RNA的提取与检测  49-50
      3.3.2.1 准备工作  49
      3.3.2.2 长春花总RNA的提取  49-50
      3.3.2.3 RNA纯度与浓度检测  50
    3.3.3 长春花mRNA的Real-Time Quantitatiove PCR检测  50-52
    3.3.4 反转录反应  52
    3.3.5 标准曲线的制作  52-53
    3.3.6 各个样品和rps9的荧光定量PCR检测  53
    3.3.7 熔解曲线分析  53-54
    3.3.8 结果的统计分析  54
  3.4 试验方案  54-55
  3.5 结果与分析  55-60
    3.5.1 生物碱合成途径中关键酶基因的相对表达量分析  55-59
      3.5.1.1 ASA基因的表达量  56
      3.5.1.2 D4H基因的表达量  56
      3.5.1.3 TDC基因的表达量  56-57
      3.5.1.4 G10H基因的表达量  57
      3.5.1.5 PRX基因的表达量  57
      3.5.1.6 SLS基因的表达量  57-58
      3.5.1.7 DAT基因的表达量  58
      3.5.1.8 GGPP基因的表达量  58
      3.5.1.9 STR基因的表达量  58-59
    3.5.2 ORCA3基因表达的组织特异性和时间特异性  59-60
    3.5.3 ORCA3调控的基因  60
  3.6 小结  60-62
第四章总结与展望  62-65
  4.1 研究结论  62-63
  4.2 后续研究方向  63-65
参考文献  65-75
致谢  75-76
攻读学位期间发表的学术论文目录  76-78

长春花叶片三种生物碱含量及合成基因表达的初步研究

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