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IGF1R抑制剂筛选模型的建立，化合物的筛选及苏木色素抗肿瘤作用研究

作　者: 童林江
导　师: 殷明；丁健
学　校: 上海交通大学
专　业: 制药工程
关键词: 胰岛素样生长因子I受体 苏木色素 细胞增殖 信号通路 凋亡 HL-60细胞
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


胰岛素样生长因子受体1(IGF1R)在许多类型的肿瘤细胞中高表达,在与肿瘤细胞增殖、迁移、耐药等相关的信号转导过程中发挥了关键的调控作用。本研究的目的是建立一个灵敏的高通量IGF1R抑制剂分子筛选模型,并寻找新型的IGF1R抑制剂。采用Bac-to-BacTM昆虫杆状病毒表达系统表达具有激酶活性的受体酪氨酸激酶IGF1R胞内区重组蛋白,并建立基于酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)原理的IGF1R抑制剂分子筛选模型。筛选得到的化合物通过采取分子对接技术以及表面等离子共振技术(SPR)来阐述其与IGF1R的相互作用模式。采用静脉内皮细胞迁移、管腔形成、大鼠动脉环、鸡胚尿囊膜等实验评价该IGF1R抑制剂的抗新生血管活性,同时采用MTT法检测该化合物对肿瘤细胞的增值抑制作用。用流式细胞术检测其诱导凋亡能力和蛋白印记法来进行。首先,我们成功构建并表达纯化了具有酶活功能的IGF1R胞内区重组蛋白,并且建立了基于ELISA原理的IGF1R抑制剂筛选模型。采用该抑制剂筛选模型对200余个化合物进行筛选并获得了一个对IGF1R酶活具有显著抑制作用的天然的小分子化合物——苏木色素(hematoxylin)。计算机分子对接结果显示苏木色素可能与IGF1R的激酶区存在直接结合。随后我们利用SPR技术观察了苏木色素与IGF1R的结合,结果显示,苏木色素与IGF1R确实存在高亲和力地结合。血管新生是IGF1R活化介导的重要效应,因此,我们进一步观察苏木色素对血管内皮细胞迁移和管腔形成等新生血管生成早期主要步骤的影响;并采用大鼠动脉环、鸡胚尿囊膜模型,评价了苏木色素在半体内、体内水平抑制新生血管生成的作用,结果表明,苏木色素能够明显抑制肿瘤新生血管生成。此外,我们在IGF1R高表达的HL60细胞中观察了苏木色素对IGF1R介导的增殖活性的影响,结果表明,苏木色素可以显著抑制HL60细胞的增殖,深入机制研究揭示,在HL60细胞中,苏木色素通过抑制了IGF1R的磷酸化从而激活了caspase凋亡级联信号通路,发挥了抗增殖的作用。本研究成功建立了灵敏、稳定的IGF1R受体酪氨酸激酶抑制剂的分子水平筛选模型,通过该模型筛选得到对IGF1R有较强抑制活性的苏木色素。本研究为研发以IGF1R受体酪氨酸激酶为靶点的新型抗肿瘤药物奠定了良好的基础,特别是IGF1R抑制剂苏木色素值得进一步研究。

全文目录


中文摘要  4-6
英文摘要  6-12
一 引言  12-21
  1 恶性肿瘤与蛋白酪氨酸激酶及其抑制剂  12-16
  2. IGF1R 及其抑制剂  16-20
  3 酪氨酸激酶筛选的活性检测评价方法及抑制剂的筛选  20
  4 研究方案  20-21
二 实验材料与方法  21-49
  1. IGF1R 胞内区蛋白的表达、纯化、蛋白活性分析  21-30
    1.1 质粒  21-22
    1.2 菌种和细胞  22
    1.3 试剂和实验材料  22-23
    1.4 实验仪器  23-24
    1.5 分子生物学常规实验方法  24
    1.6 酪氨酸激酶的激酶区蛋白的表达、纯化  24-28
      1.6.1 IGF1R 胞内区重组质粒的构建  24-27
      1.6.2 重组蛋白的表达  27
      1.6.3 重组蛋白的纯化  27-28
    1.7 胞内区重组蛋白的鉴定  28-29
    1.8 重组蛋白的活性分析  29-30
  2. IGF1R 抑制剂分子水平筛选模型的建立  30-34
    2.1 试剂和实验材料  32
    2.2 阳性对照化合物  32
    2.3 实验仪器  32
    2.4 基于酶联免疫吸附法的酪氨酸激酶抑制剂筛选模型的建立  32-34
  3. IGF1R 抑制剂分子水平的筛选及活性化合物苏木色素的抗肿 瘤作用研究  34-43
    3.1 实验材料  35-36
      3.1.1 试剂和耗材  35
      3.1.2 待筛化合物和阳性对照化合物  35
      3.1.3 实验仪器  35-36
      3.1.4 细胞培养  36
    3.2 实验方法  36-43
      3.2.1 基于酶联免疫法（ELISA）的酪氨酸激酶抑制剂分子水平筛选  36-38
        3.2.1.1 化合物筛选中各实验孔的设立  36-37
        3.2.1.2 化合物筛选中有效性评价标准  37
        3.2.1.3 筛选步骤  37-38
      3.2.2 Western Blot 检测  38-39
        3.2.2.1 抗体  38
        3.2.2.2 实验步骤  38-39
      3.2.3 细胞增殖抑制试验  39-40
      3.2.4 表面等离子共振（SPR）检测苏木色素和IGF1R 的亲和力  40
      3.2.5 分子对接  40-41
      3.2.6 HMEC-1 细胞迁移实验  41
      3.2.7 HMEC-1 细胞管腔形成实验  41-42
      3.2.8 大鼠动脉环实验  42
      3.2.9 CAM 血管生成模型  42-43
  4 苏木色素的抗肿瘤细胞凋亡机制的研究  43-49
    4.1 药物和试剂  45
    4.2 主要仪器  45-46
    4.3 细胞培养  46
    4.4 MTT 法检测细胞增殖  46
    4.5 DAPI 染色法  46-47
    4.6 流式细胞术检测细胞凋亡  47
      4.6.1 PI 单染法检测苏木色素引起HL60 细胞的凋亡  47
      4.6.2 Annexin-V/PI 双染检测苏木色素引起HL60 细胞凋亡  47
    4.7 Western Blot 检测  47-49
      4.7.1 抗体及试剂  47-48
      4.7.2 实验步骤  48-49
三 结果  49-72
  1.IGF1R 胞内区蛋白的表达、纯化、蛋白活性分析  49-53
    1.1 胞内区表达质粒的构建  49
    1.2 重组Bacmid/IGF1R-CDde鉴定  49-50
    1.3 重组IGF1R 蛋白的表达与纯化  50-51
    1.4 重组IGF1R 蛋白的活性分析  51-53
  2.IGF1R 抑制剂分子水平筛选模型的建立  53-57
    2.1 基于ELISA 原理酪氨酸激酶分子水平筛选模型的建立  53-55
    2.2 IGF1R 酪氨酸激酶抑制剂的筛选模型的建立和验证  55-57
  3. IGF1R 抑制剂分子水平的筛选及活性化合物苏木色素的抗肿 瘤作用研究  57-68
    3.1 苏木色素对IGF1R 和IR 激酶活性的抑制作用  57-58
    3.2 苏木色素与IGF1R 有高亲和力  58-59
    3.3 对苏木色素和IGF-1R 酪氨酸激酶域的对接结合模式的分析  59-60
    3.4 细胞水平苏木色素对IGF1R 受体及其下游信号分子磷酸化的影响  60-61
    3.5 苏木色素影响HMEC-1 细胞的迁移  61-63
    3.6 苏木色素抑制HMEC-1 细胞管腔形成  63-64
    3.7 苏木色素抑制大鼠动脉环血管生成  64-65
    3.8 苏木色素抑制CAM 血管生成  65-68
  4 苏木色素的抗肿瘤细胞凋亡机理的研究  68-72
    4.1 MTT 法检测细胞增殖  68
    4.2 苏木色素在HL60 细胞上引起凋亡  68-69
    4.3 苏木色素诱导HL60细胞发生凋亡  69-70
    4.4 苏木色素激活capase-3-，8-，9，同时引起PARP.的切割增加  70-72
四 讨论  72-80
  1.IGF1R 胞内区蛋白的表达、纯化、蛋白活性分析  72-74
  2.IGF1R 抑制剂分子水平筛选模型的建立  74-76
  3.IGF1R 抑制剂分子水平的筛选及活性化合物苏木色素的抗肿瘤作用研究  76-79
  4 苏木色素的抗肿瘤细胞凋亡机制的研究  79-80
五 结论  80-81
参考文献  81-87
致谢  87-88
攻读学位期间发表论文目录  88

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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