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盐酸普鲁卡因对人结肠癌HT-29细胞Syk基因甲基化及表达的影响

作　者: 高曰文
导　师: 朱耀明
学　校: 三峡大学
专　业: 外科学
关键词: PCA DNA甲基化 Syk基因 HT-29细胞 细胞增殖
分类号: R735.35
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 18次
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内容摘要


目的:DNA甲基化是调控基因表达的一种重要的表观遗传学过程,人类肿瘤的产生和发展与抑癌基因的DNA甲基化异常有密切关系。研究表明DNA甲基化是一种可逆的过程,因此通过去甲基化药物消除基因启动子区域的甲基化状态,可使沉默的肿瘤抑癌基因重新表达,从而恢复其正常功能,达到治疗肿瘤的目的。现在利用药物对肿瘤进行去甲基化的研究主要集中在2个方面,一类是核苷类似物,如5-Aza-2’-d eo- xycytidin等;一类是非核苷类似物,如普鲁卡因等。前者是目前已知很强的甲基化酶抑制剂,但在临床试验中核苷类似物已经证实有强的毒副作用,限制了其在临床中的应用。因此寻找新的、有潜在效用的去甲基化新药成为当前国内外研究的热点领域。本课题组在前人研究的基础上,探讨盐酸普鲁卡因(procaine,PCA)对人结肠癌HT-29细胞Syk基因甲基化及表达的影响,分析药物处理前后Syk基因甲基化状态和表达的关系,并探讨PCA抑制人结肠癌HT-29细胞增殖的分子机制,以期为人结肠癌的发病遗传学机制及治疗提供新的思路并找到新的理论依据。方法:在本次研究中,我们成功构建体外甲基化DNA(IVD)和非甲基化(NL)的阳性对照,采用巢式双重甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation- specific PCR, MSP)检测HT-29细胞中Syk基因甲基化状况;逆转录-聚合酶链反应( RT-PCR)检测HT-29细胞内Syk基因表达情况。应用不同浓度(0-10mmol/L)PCA处理人结肠癌HT-29细胞,采用MSP检测PCA处理前后HT-29细胞中Syk基因启动子的甲基化水平,RT-PCR和蛋白印迹技术(WB)观察药物处理后HT-29细胞内Syk基因表达情况。通过倒置显微镜观察药物处理前后细胞形态学改变,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞存活率,流式细胞术(FCM)观察细胞周期变化情况。结果:1、MSP发现在引物覆盖的区域中,HT-29细胞Syk基因启动子存在甲基化,RT-PCR显示在HT-29细胞中Syk基因低表达,表明HT-29细胞中Syk基因启动子甲基化可能是导致其表达沉默的一种机制。2、MSP检测证实经PCA处理能够使HT-29细胞中Syk基因甲基化水平下降;RT-PCR和蛋白印迹技术结果显示Syk基因经PCA处理后在人结肠癌HT-29细胞中表达上调。3、通过倒置显微镜观察发现PCA处理后的HT-29细胞呈现缩小、皱缩、空泡、脱壁等增殖变慢的形态学特征;MTT结果分析表明PCA能显著抑制HT-29细胞增殖,其抑制率呈药物浓度及时间依赖性;FCM结果显示PCA可以使HT-29细胞的G0/G1延长,S期缩短。结论:人结肠癌HT-29细胞中Syk基因启动子甲基化导致基因失表达可能是结肠癌发病的机制之一;PCA能逆转Syk基因启动子区域CpG岛甲基化,并使Syk基因活化并表达上调;同时PCA能够使HT-29细胞的生长阻滞在G0/G1期,从而显著抑制HT-29细胞的增殖。因此我们的研究支持,PCA是一种建立在表观遗传学基础上对未来肿瘤治疗很有前途的候选药物。

全文目录


内容摘要  4-6
Abstract  6-9
英文缩略词表  9-11
引言  11-13
材料与方法  13-23
结果  23-29
  第一部分：人结肠癌HT-29 细胞Syk 基因表达沉默机制实验研究  23-24
  第二部分：PCA 体外诱导人结肠癌HT-29 细胞Syk 基因去甲基化的研究  24-25
  第三部分：PCA 对人结肠癌HT-29 细胞增殖抑制及其作用机制实验研究  25-29
讨论  29-32
小结  32-33
参考文献  33-36
综述  36-42
  参考文献  39-42
后记  42-43
附录：攻读硕士学位期间发表的部分学术论著  43

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肠肿瘤 > 结肠肿瘤
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