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芯片探针杂交效率的影响因素分析

作　者: 严国权
导　师: 郭江峰；丁先锋
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 覆瓦式探针 DNA芯片 二级结构 探针/靶序列杂交双链 Riboswitch
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


芯片技术是近年发展起来的高通量筛选技术,已应用于生命科学研究的诸多领域,特别是在基因组再测序、基因多态性的信息检测和基因表达检测等方面得到快速发展和应用。芯片技术操作流程探针设计、芯片制备、样本纯化标记、芯片杂交、信号检测和芯片数据分析。探针设计是芯片实验过程的关键环节,其质量的优劣将直接影响最终的芯片实验结果。探针的筛选主要是根据探针灵敏度和特异性的要求,选择一个或多个靶标序列的候选探针,使芯片上的探针能与靶标结合而与非靶标不发生结合,从而有效的完成芯片杂交过程。寡核苷酸探针可以提高靶序列特异性,改善探针与标记样本的杂交特性,并且可更好地区分来自像剪切体或同一基因家族的相似靶序列。靶序列的二级结构是一种很普遍的现象,即使在较高温度下靶序列形成的双链也能稳定存在。在很多优化探针设计的软件中,未考虑靶序列二级结构对杂交的影响。靶序列二级结构是干扰杂交的潜在因素,同时也是影响分析芯片结果、设计芯片标准的重要因素。在寡核苷酸探针设计的过程中引入靶序列二级结构的因素,可以改变最优探针的选择。本实验通过对加强型绿色荧光蛋白(EGFP)RNA序列进行覆瓦式探针设计,制作原位合成的微流体芯片,研究探针／靶序列杂交双链AG、Tm、靶序列二级结构和探针末端碱基因素对芯片杂交信号值的影响。结果表明,相同ΔG和Tm值的探针／靶序列杂交双链的杂交信号值存在较大差异,探针／靶序列杂交双链ΔG和Tm值对芯片杂交信号值影响没有明显的规律性；表征靶序列二级结构信息的探针PT-sc参数与芯片杂交信号值间呈较好的线性关系；探针5’末端碱基组成对芯片杂交信号值也有影响,5’末端碱基为G/C的探针杂交信号值总体上高于其邻近的5’末端碱基为A/T的探针的杂交信号值。通过Riboswitch覆瓦式探针芯片实验对考虑了靶序列二级结构的Mfold Probe和ArrayDesigner Probe进行比较,表明考虑RNA二级结构,可以明显提高探针的筛选效果。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-10
第一章 绪论  10-27
  1.1 DNA芯片技术  10-18
    1.1.1 DNA芯片的产生及原理  10-12
    1.1.2 DNA芯片的发展过程  12-14
    1.1.3 DNA芯片制造方法  14-16
    1.1.4 DNA芯片的分类  16-18
  1.2 芯片探针设计国内外研究现状  18-24
    1.2.1 探针对芯片杂交的影响  18-20
    1.2.2 RNA二级结构及其预测  20-24
    1.2.3 RNA二级结构对芯片探针设计的影响  24
  1.3 核糖开关(Riboswitch)  24-25
  1.4 论文的主要内容  25-27
第二章 EGFP覆瓦式芯片实验探针设计及数据分析  27-38
  2.1 实验试剂材料  27
    2.1.1 材料  27
    2.1.2 试剂与仪器  27
  2.2 实验方法  27-28
    2.2.1 芯片探针设计及芯片合成  27
    2.2.2 靶序列制备及芯片杂交  27-28
    2.2.3 靶序列(EGFP)二级结构预测及其探针参数计算  28
  2.3 芯片数据结果分析  28-38
    2.3.1 探针(DNA)/靶序列(EGFP RNA)杂交双链ΔG及其Tm值分析  28-30
    2.3.2 探针PT-sc参数对杂交信号值的影响  30-34
    2.3.3 探针5’末端碱基组成对芯片杂交信号值的影响  34-35
    2.3.4 探针影响因素的交叉分析  35-38
第三章 Riboswitch覆瓦式芯片实验及数据分析  38-44
  3.1 实验部分  38
    3.1.1 材料  38
    3.1.2 试剂与仪器  38
    3.1.3 实验方法  38
  3.2 ArrayDesigner探针设计软件  38-39
  3.3 RSW最优探针设计  39-42
    3.3.1 Mfold Probe(MF Probe)探针设计  39
    3.3.2 ArrayDesigner Probe(AD Probe)探针设计  39-42
  3.4 RSW芯片数据分析  42-44
第四章 结论与讨论  44-45
参考文献  45-50
致谢  50-51
附录1 预测的34个EGFP二级结构  51-55
附录2 701条EGFP覆瓦式探针相关参数及芯片实验结果  55-70

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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