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p73转录水平在苯并（a）芘致MRC-5和H1299细胞死亡中的作用

作　者: 饶凯敏
导　师: 袁晶
学　校: 华中科技大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 苯并(a)芘 MTT 单细胞凝胶电泳 RT-qPCR 细胞死亡
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

多环芳烃类化合物(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)在环境中分布广泛。其中苯并(a)芘(benzo[a]pyrene, BaP)是PAHs中最具代表性的环境致癌物。它主要来源于交通运输、工业生产以及生活环境中有机物的热分解与不完全燃烧。流行病学研究表明:BaP的暴露与人类多种肿瘤的发生有关,如肺癌和皮肤癌。实验研究发现BaP可阻断细胞生长分化调节的信号转导,与DNA形成加合物,导致细胞周期阻滞和细胞死亡。细胞死亡包括细胞凋亡和细胞坏死两种形式。细胞凋亡是细胞自发的、程序性的死亡过程。坏死则是因病理而产生的被动死亡。当调控细胞凋亡的细胞因子受抑制时,细胞的死亡形式则可能由凋亡转为坏死。研究证据显示:抑癌基因p53介导的细胞信号通路参与BaP致细胞增值和凋亡中的调控。但是,p73在BaP致细胞死亡中的调控机制仍有待深入研究。p73是p53的重要家族成员成员之一。它在结构和功能上与p53有相似性。p73可激活p53下游调控细胞周期和凋亡的靶基因,从而参与BaP致细胞DNA损伤的应答反应。然而,p73与p53在功能与激活机制上也有差异性。p73能否独立于p53而介导BaP诱导的细胞凋亡和坏死尚无确切报道。基于此,本研究以人胚肺成纤维细胞(MRC-5)和p53缺失的人肺腺癌细胞(H1299)为靶细胞,设定BaP染毒组(8μM、16μM、32μM、64μM和128μM )、溶剂对照组(S9+DMSO+含%5血清培养基(S9终浓度为3‰DMSO终浓度<1‰)和空白对照组处理细胞24 h。用MTT实验和单细胞凝胶电泳技术分别评价细胞的活力和靶细胞DNA的损伤程度。同时,用流式细胞术评价BaP对靶细胞细胞周期阻滞和死亡的影响。用实时荧光定量PCR技术检测p73主要上游基因及其下游细胞死亡和周期阻滞相关基因的mRNA水平,可望为进一步研究篇p53非依赖性信号通路在BaP致细胞死亡中的调控作用提供科学线索。本研究主要结果如下:1.细胞活力实验用设定浓度的BaP染毒(8μM、16μM、32μM、64μM和128μM )处理MRC-5和H1299细胞24 h时。在MRC-5细胞,与溶剂对照组相比,除8μM BaP染毒组外,其它BaP处理组细胞的存活率均显著下降(P<0.05);128μM BaP染毒组的细胞存活率降低了30%。在H1299细胞,所有BaP染毒组的细胞存活率均显著性降低(P<0.05),并呈剂量-效应关系。相对溶剂对照相细胞而言,32μM BaP染毒组细胞的存活率降低了40%。2.单细胞凝胶电泳实验用设定浓度的BaP分别染毒MRC-5细胞和H1299细胞24 h。在MRC-5细胞,与溶剂对照组相比,各BaP处理组细胞的DNA损伤程度均显著增加(P<0.01),峰值在在64μM BaP染毒组。在H1299细胞,BaP致DNA损伤程度是随着染毒浓度的增加而显著增加(P<0.01),有剂量-效应依赖关系。3.流式细胞术实验用设定浓度的BaP分别染毒MRC-5细胞和H1299细胞24 h,用流式细胞术检测各时相细胞数。在MRC-5细胞,与溶剂对照组相比,BaP主要引起G1期细胞阻滞。所有染毒组的凋亡细胞数量与溶剂对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。但是,所有染毒组的坏死细胞数量百分比与溶剂对照组相比均显著性增加(P<0.05)。在H1299细胞,BaP引起的细胞周期阻滞则主要在G2期。所有BaP染毒组的坏死细胞数量百分比与溶剂对照组相比均显著性增加(P<0.05);相对MRC-5细胞的各染毒组均显著性升高(P<0.05)。但是,凋亡细胞数仅在128μM BaP染毒组有显著性增加(P<0.05)。4.实时荧光定量PCR实验用设定浓度的BaP染毒MRC-5细胞24 h,除16μM BaP染毒组外,其它染毒组ATM基因mRNA表达水平均显著增加(P<0.05)。E2F1和Bcl-2基因mRNA仅在16μM和128μM BaP染毒组有显著性表达(P<0.05)。除16μM和128μM BaP染毒组外,其它染毒组的Puma基因mRNA表达水平均显著增加(P<0.05)。所有染毒组p53,p73和p21基因的mRNA表达水平均显著增加(P<0.05)。但是,在所有BaP染毒组并未检出14-3-3σ,ATR,Bax,Noxa和caspase3基因mRNA的显著性表达(P>0.05)。用设定浓度的BaP染毒H1299细胞24 h,除32μM和64μM BaP染毒组外,其它染毒组ATM和ATR基因mRNA表达水平均显著增加(P<0.05)。E2F1, p73和Puma基因mRNA在所有BaP染毒组均有显著性表达(P<0.05)。除64μM BaP染毒组外,其它染毒组Bcl-2基因mRNA表达水平均显著增加(P<0.05)。但是,在所有BaP染毒组均未检出Gadd45,Bax,Noxa和caspase3基因mRNA的显著性表达(P>0.05)。以上研究结果表明:在本实验条件下,BaP导致了MRC-5细胞和H1299细胞存活率的降低和较强的DNA损伤。BaP诱导的DNA损伤可能激活了p73在mRNA水平参与的p53非依赖性细胞坏死信号调控通路。

全文目录

全文缩写词  6-7
摘要  7-10
ABSTRACT  10-13
前言  13-17
材料和方法  17-27
结果  27-35
讨论  35-37
小结  37-38
参考文献  38-43
综述  43-56
  参考文献  52-56
硕士在读期间发表论文目录  56-57
致谢  57

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