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尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒的构建及鉴定

作　者: 陈文昭
导　师: 黄山虎
学　校: 南昌大学
专　业: 外科学
关键词: EWS-FLI1融合基因尤文肉瘤原核表达质粒
分类号: R738.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的:构建尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒。方法:从人尤文肉瘤A673细胞中提取总RNA,以RT-PCR法扩增EWS-FLI1基因序列,目的基因两侧引入SacⅠ和HindⅢ酶切位点,克隆至pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆作PCR鉴定、酶切鉴定及测序鉴定。再将EWS-FLI1基因亚克隆至原核表达载体pQE30中,构建重组原核表达质粒pQE30-EWS-FLI1,酶切及测序鉴定。所构建的重组质粒转化JM109, IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳后转印到NC膜上,进行Western blot鉴定。结果:PCR结果显示扩增片段大小约为1.5kb,双酶切鉴定目的基因片段大小约为1.5kb,阳性克隆测序结果显示目的基因序列与预期相同。所构建重组质粒在大肠杆菌中表达出与预期大小相符的54 kDa蛋白,经Western blot鉴定系EWS-FLI1蛋白。结论:成功构建了pQE30-EWS-FLI1,并进行了原核表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-6
第1章引言  6-7
第2章材料与方法  7-20
  2.1 实验材料  7-8
    2.1.1 细胞、质粒和菌株  7
    2.1.2 主要试剂与材料  7-8
  2.2 常用试剂的配置  8-11
    2.2.1 主要培养基配方  8-10
    2.2.2 主要仪器设备  10-11
  2.3 实验方法  11-20
    2.3.1 目的基因的获取及克隆测序  11-15
    2.3.2 目的基因亚克隆  15-17
    2.3.3 重组质粒的诱导表达及产物鉴定  17-20
第3章结果  20-24
第4章讨论  24-26
第5章结论  26-27
致谢  27-28
参考文献  28-29
攻读学位期间的研究成果  29-30
综述  30-35

尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒的构建及鉴定

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