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NFBD1在宫颈癌标本中的表达及其shRNA逆转录病毒载体的构建

作　者: 程莉
导　师: 宋方洲
学　校: 重庆医科大学
专　业: 生化与分子生物学
关键词: 宫颈癌 基因功能 NFBD1 逆转录病毒载体
分类号: R737.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


NFBD1(a nuclear factor with BRCT domain 1),又被称为DNA损伤关卡蛋白(mediator of DNA damage checkpoint protein1 MDC1),属于BRCT蛋白超家族成员。NFBD1在DNA损伤应答通路中具有重要作用,许多研究者猜测,NFBD1可能是一个潜在的肿瘤抑制基因。但是又有相关研究表明NFBD1不是一个典型的肿瘤抑制基因,它能与p53蛋白相互作用,进而抑制p53的表达促进细胞凋亡,这提示NFBD1可能与细胞的生长有着密切的关系,而并不是抑癌基因。另外有研究表明阻断NFBD1的药物可以提高化疗或放疗的效果,增强NFBD1的药物能够减少化疗或者放疗的副作用以及防止人们受高剂量射线的有害影响。由此我们推测,NFBD1可以作为一个非常有效的肿瘤治疗药物靶点用于研究,这样的研究将是很有意义和价值的。宫颈癌是严重威胁着妇女健康的一种疾病,其具有较长的癌前病变阶段,如果能尽早的发现并确诊,将大大提高宫颈癌的治疗效果以及降低宫颈癌的致命率。鉴于相关研究所发现的NFBD1在DNA损伤应答中的作用及对细胞生长、周期、凋亡的影响,本课题的主要目的即是为探讨NFBD1在宫颈癌中的作用以及作用机制做基础的铺垫工作,通过收集大量的临床宫颈癌病例标本,检测NFBD1在宫颈癌组织与对应正常组织中的表达差异情况,然后构建NFBD1 shRNA逆转录病毒载体,并检测其对NFBD1的干扰效果,为以后研究探索NFBD1对宫颈癌细胞的生长、周期和凋亡的作用和作用机制奠定基础。第一部分NFBD1在宫颈癌标本中的表达目的:收集临床标本,在mRNA水平和蛋白质水平分别检测NFBD1基因在宫颈癌组织与对应正常组织中的表达情况。方法:提取标本的mRNA,通过逆转录获取NFBD1 cDNA,再用普通PCR反应及实时荧光定量PCR相对定量法进行检测,用2-ΔΔCt对数据进行处理和做统计分析;在蛋白质水平,将标本制成石蜡切片,通过免疫组化染色实验,检测NFBD1基因的蛋白质表达情况。结果:mRNA水平,在39例标本的检测中发现,有24例标本中NFBD1在宫颈癌组织中的表达明显比对应正常组织中的表达高,占61.5%;在蛋白质水平,60例标本的检测中发现,有42例标本中NFBD1在宫颈癌组织中的表达比对应正常组织中的表达高,占70%。结论:NFBD1基因在宫颈癌组织中的表达无论是mRNA水平还是蛋白质水平都比正常组织中的表达高,由此我们推测,NFBD1基因可能在宫颈癌的发生发展中起着重要的作用。第二部分NFBD1 shRNA逆转录病毒载体的构建目的:构建NFBD1 shRNA逆转录病毒载体,然后在包装细胞PT67中包装出病毒感染SiHa细胞系,提取RNA和蛋白质检测干扰效果,为以后研究NFBD1基因在宫颈癌中的作用及机制做实验准备。方法:将Psilencer5.1-H1-Retro载体线性化后与设计合成的NFBD1 shRNA序列连接,经转化筛选后提取质粒测序鉴定,鉴定正确的重组载体质粒经PT67细胞包装出病毒,再感染siha细胞后提取RNA和蛋白质,用Real time PCR和Western-bloting检测NFBD1在mRNA和蛋白质表达水平的沉默效果。结果:经测序鉴定证实Psilencer-shRNA-NFBD1-1和Psilencer-shRNA-NFBD1-2均构建成功,提取质粒经PT67包装后感染SiHa细胞效果较好,Real time PCR和Western blotting结果均表明,经Psilencer-shRNA-NFBD1-1和Psilencer-shRNA-NFBD1-2干扰后NFBD1在mRNA水平和蛋白质水平的表达均明显降低,并且Psilencer-shRNA -NFBD1-2的干扰效果更好。结论:NFBD1 shRNA逆转录病毒载体构建成功,具有明显的干扰效果,并且可以将Psilencer-shRNA-NFBD1-2用于以后的研究中。

全文目录


符号说明  5-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-13
前言  13-15
第一部分 NFBD1 在宫颈癌中的表达  15-30
  1 实验材料  16-17
  2 实验方法  17-21
  3 结果  21-25
  4 讨论  25-28
  小结  28-29
  参考文献  29-30
第二部分 NFBD1 shRNA 逆转录病毒载体的构建  30-46
  1 实验材料  31-33
  2 实验方法  33-40
  3 结果  40-42
  4 讨论  42-44
  小结  44-45
  参考文献  45-46
全文总结  46-47
文献综述  47-56
致谢  56-57
攻读硕士期间发表的论文  57

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 子宫肿瘤
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