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Lenti-EGFP转染离体兔角膜上皮细胞的实验研究

作　者: 王继东
导　师: 杜之渝
学　校: 重庆医科大学
专　业: 眼科学
关键词: 慢病毒角膜上皮细胞有效性安全性细胞实验
分类号: R774.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的观察慢病毒(lentivirus)载体用于角膜上皮细胞基因转染的有效性及安全性。方法角膜上皮细胞的原代及传代培养并应用免疫荧光技术做细胞鉴定。慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白(lenti-EGFP)以不同的感染复数(MOI=0,1,10,50,100,500)转染实验细胞,于转染后24、48、72、96h运用倒置荧光显微镜观察不同感染复数(MOI)下增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达并计算细胞转染率,测定最佳转染剂量,即最适感染复数;RT-PCR方法检测EGFP基因的表达情况。lenti-EGFP以最适感染复数转染角膜上皮细胞,通过组织化学技术(HE染色、透射电子显微镜)观察正常角膜上皮细胞及转染细胞的形态及超微结构变化;流式细胞技术(FCM)检测慢病毒载体对角膜上皮细胞凋亡的影响。结果EGFP于转染48h即开始有表达,随着转染时间的延长其表达增强。MOI=1、10、50、100时,角膜上皮细胞转染率随着感染复数的增加而增加,各感染复数下的细胞转染率差异有统计学意义(P<0.05),MOI在100与500时,转染率差异无统计学意义(P>0.05),即最适感染复数为100。RT-PCR结果提示转染组细胞内EGFP基因有明确表达。当MOI=100时,角膜上皮细胞HE染色提示转染细胞形态规则,与正常角膜细胞形态一致;透射电子显微镜观察转染细胞超微结构与正常细胞无明显差别。流式细胞术检测转染组细胞凋亡率与正常组细胞无明显差别(P>0.05)。结论lenti-EGFP能够有效、安全地转染离体兔角膜上皮细胞。

全文目录

英汉缩略语名词对照  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
前言  10-14
  参考文献  12-14
第一部分 lenti-EGFP 转染角膜上皮细胞的有效性观察  14-27
  1 材料与方法  14-22
  2 结果  22-24
  3 讨论  24-26
  4 小结  26-27
第二部分 lenti-EGFP 转染角膜上皮细胞的生物安全性检测  27-33
  1 材料与方法  27-30
  2 结果  30
  3 讨论  30-32
  4 小结  32-33
全文结论  33-34
附图  34-38
参考文献  38-40
文献综述  40-48
致谢  48-49
攻读硕士学位期间发表的文章  49

Lenti-EGFP转染离体兔角膜上皮细胞的实验研究

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