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增强UV-B辐射对小麦幼苗基因组DNA的影响

作　者: 李苗
导　师: 韩榕
学　校: 山西师范大学
专　业: 植物学
关键词: 小麦 UV-B DNA RAPD分析差异条带类黄酮总多酚活性氧
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本文以“晋麦8号”六日龄小麦叶片为试验材料,通过不同的方法提取其基因组DNA,优化并建立了适合本实验室的小麦RAPD反应体系。在此基础上,采用增强的UV-B(10.08 kJ·m-2·d-1)辐射处理小麦幼苗,利用RAPD标记分析了UV-B辐射对小麦基因组DNA的影响作用。此外,本文还对UV-B辐射处理下小麦幼苗的三种生化指标进行了测定,以初步探究小麦抗UV氧化的途径。结果表明:(1)采用改进的CTAB法提取小麦总DNA,效果较好,提取物可用于随后的RAPD分析。(2)UV-B辐射使DNA增色效应减小,且随着辐射剂量的增强,DNA增色效应呈下降趋势。推测UV-B胁迫可导致DNA发生链间交联,且交联程度与辐射剂量呈正相关。(3)分别对影响扩增的各种因素如模板DNA、引物、dNTPs及Taq酶等设立浓度梯度实验。结果表明,25μL反应体系中最佳的参数值为:模板DNA 20ng、引物浓度0.5μmol/L、dNTPs浓度200μmol/L、Taq酶0.750U。反应程序为:94℃预变性2min, 94℃变性30s,38℃退火30s,72℃延伸30s,30个循环,72℃延伸10min,4℃保存。(4)从50条随机引物中筛选出12条扩增条带清晰、多态性高、重复性好的RAPD引物。结果显示,有7条引物在对照组与UV-B处理组间可以扩增出差异条带。B组与对照相比,引物S22在分子量为2,200bp处出现了一条特异性条带,且1,500bp处的条带亮度增强,其它带型基本一致;引物S33、S40、S123及S160分别扩增出1,600bp、2,100bp、1,100bp及800bp的片段。经引物S158扩增的B组DNA缺失了一条分子量为700bp的条带,而450bp处的条带亮度较CK组增强。AW78254的扩增图谱显示,B组DNA缺失了一条分子量为1,200bp的条带。由此说明,一定剂量的UV-B辐射可导致DNA分子发生变异。(5)UV-B辐射对植物基因组DNA的影响虽然具有不稳定性,但本实验扩增出的两条差异片段S22-2,200及S40-2,100在不同批次的小麦试材中重复出现,说明UV-B诱导的DNA变异亦存在必然性。推测这两条片段可能与UV-B对小麦造成损伤的分子机制有关。(6)实验对DNA回收试剂盒的方法加以改进,成功回收了稳定出现的两条差异片段:S22-2,200及S40-2,100。电泳检测的结果表明,回收的DNA纯度高,但条带亮度较弱。由于回收产物的浓度较低,达不到序列测定的要求,因此需对DNA回收方法做进一步的优化。(7)测定结果显示,对照组小麦细胞中即含有一定浓度的O2.-,随着UV辐射剂量和处理天数的增加,O2.-含量呈显著上升趋势,且剂量效应较为明显;黄酮类化合物浓度变化趋势与O2.-相似,亦与辐照剂量及时间呈正相关;从总多酚含量变化来看,小麦材料在UV-B照射前后反应差异很大。随着UV-B辐射剂量的增强,多酚含量先升高,辐射剂量为13.5 kJ·m-2·d-1时达到峰值,而后又下降;随着辐照天数的递增,总多酚含量总体呈上升趋势,从处理的第4到6天,B3组(17.3 kJ·m-2·d-1)总多酚含量低于B2组(13.5 kJ·m-2·d-1)。通过对黄酮、总多酚物质的含量进行对比,推测小麦细胞可能主要通过快速的应激反应产生大量的保护物质,直接吸收UV以抵御其氧化造成的损伤。

全文目录

摘要  3-6
Abstract  6-12
1 前言  12-24
  1.1 UV-B 与植物间的相互作用  12-17
    1.1.1 增强UV-B 辐射对植物的生物学效应  12-15
    1.1.2 植物对UV-B 的防护与适应  15-17
  1.2 分子标记技术  17-21
    1.2.1 分子标记技术的主要类型及其特点  17-19
    1.2.2 RAPD 标记  19-20
    1.2.3 RAPD 标记在小麦研究中的应用  20-21
  1.3 小麦基因克隆的研究进展  21-22
  1.4 本文研究的目的及主要内容  22-24
2 材料与方法  24-34
  2.1 材料及其培养  24
    2.1.1 处理设置  24
    2.1.2 UV-B 辐射处理  24
  2.2 主要试剂  24-25
  2.3 主要仪器  25-26
  2.4 UV-B 辐射对小麦基因组DNA 的影响  26-30
    2.4.1 DNA 提取方法比较  26-27
    2.4.2 DNA 质量检测  27
    2.4.3 限制性内切酶消化  27-28
    2.4.4 DNA 增色效应的测定  28
    2.4.5 随机引物干粉的稀释  28
    2.4.6 随机引物的筛选  28
    2.4.7 小麦RAPD 体系的优化  28-29
    2.4.8 UV-B 辐射对小麦RAPD 条带的影响  29
    2.4.9 差异条带的回收  29-30
  2.5 UV-B 辐射后小麦叶片中生理指标的测定  30-34
    2.5.1 UV-B 辐射对小麦叶片中氧自由基含量的影响  30-31
    2.5.2 UV-B 辐射对小麦叶片中类黄酮含量的影响  31
    2.5.3 UV-B 辐射对小麦叶片中总多酚含量的影响  31-32
    2.5.4 数据分析  32-34
3 结果与分析  34-46
  3.1 UV-B 辐射对小麦基因组DNA 的影响  34-41
    3.1.1 小麦叶片基因组DNA 提取方法比较  34
    3.1.2 不同剂量的UV-B 辐射对小麦DNA 结构的影响  34-35
    3.1.3 小麦RAPD 优化体系的建立  35-39
    3.1.4 UV-B 辐射对小麦基因组DNA RAPD 扩增结果的影响  39-40
    3.1.5 特异性DNA 片段的回收  40-41
  3.2 UV-B 辐照生理指标的测定  41-46
    3.2.1 UV-B 辐射对小麦叶片中氧自由基含量的影响  41-42
    3.2.2 UV-B 辐射对小麦叶片中类黄酮含量的影响  42-43
    3.2.3 UV-B 辐射对小麦叶片中总多酚含量的影响  43-46
4 讨论  46-52
  4.1 DNA 提取方法比较  46
  4.2 UV-B 辐射对小麦叶片基因组DNA 的损伤  46-47
  4.3 小麦RAPD 优化体系的建立  47-48
  4.4 UV-B 辐射处理后的小麦RAPD 图谱分析  48-49
  4.5 UV-B 辐射对小麦三种生理指标的影响  49-52
    4.5.1 UV-B 辐射对小麦叶片超氧阴离子含量的影响  49
    4.5.2 UV-B 辐射对小麦叶片类黄酮含量的影响  49-50
    4.5.3 UV-B 辐射对小麦叶片总多酚含量的影响  50-52
5 结论  52-54
致谢  54-55
参考文献  55-67
附录  67

增强UV-B辐射对小麦幼苗基因组DNA的影响

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