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作用于nAChR α3β2亚型特异α-芋螺毒素的设计合成及该靶点的功能研究

作　者: 赵重甲
导　师: 戴秋云
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: nAChR 芋螺毒素镇痛活性荧光标记电生理
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)广泛分布于肌肉、中枢神经系统和外周神经系统,调节神经与肌肉的信号传导,与学习、感觉、烟碱成瘾、神经紊乱及帕金森症密切相关,是目前最受关注得离子通道及膜蛋白之一。最新研究表明nAChR受体α3β2亚基与镇痛等有关。本课题以作用于nAChR受体α3β2的α-芋螺毒素AnIB为模板,根据α-芋螺毒素对该受体亚型的选择性要求,设计了一系列α型芋螺毒素突变体,利用一步及分布氧化法进行了氧化折叠,纯化得到了8个多肽。为评价该系列衍生物的药理学活性,应用大鼠坐骨神经半切模型,评价了多肽的镇痛活性。合成了AnI B[A11G]荧光标记物,并测定了nAChRα3β2亚型在小鼠脑内分布。为了进一步测定AnIB突变体对α3β2的活性及选择性关系,我们构建了双电极电压钳研究α3β2的电生理平台。我们从大鼠脑内、肺部等组织克隆nAChR10个亚基,并构建pcDNA3.1(+)和pcI表达载体。获得主要结果如下:1.合成了8个α型芋螺毒素突变体,其中3个采用一步氧化折叠方法合成, 5个用两步法合成,氨基酸突变后影响芋螺多肽的折叠效率。2.由AnIB及vc1.1组成的杂合肽(GCC SDPR CAGNNQDYC-NH2,Z-1)具有很强的镇痛活性,高于对照肽Vc1.1,其余研究的多肽活性接近或低于Vc1.1。3. 5-TAMRA-AnIB[A11G]荧光标记物主要分布于小鼠大脑海马区,少量分布于纹状体,在小脑及脑部其它区域分布很少或没有分布。而对照组5-TAMRA除皮层外非选择性结合了脑内区域。α3β2的在脑内的分布与其镇痛功能的发挥相对应。4.克隆了大鼠nAChRα2、α3、α4、α6、α7、α9、α10、β2、β3、β4等十个亚基,克隆中克服nAChR亚基mRNA峰度低、GC含量高、同源性较高、片断长、保真性等问题,并构建pcDNA3.1(+)和pcI表达载体。将nAChR受体经体外转录为编码nAChR受体并加帽的cRNA,显微注射到爪蟾卵母细胞。目前仪器正在调试中。

全文目录

缩略词表  6-7
摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
第一章前言  10-16
  1.1 乙酰胆碱受体概述  10
  1.2 α型芋螺毒素研究进展  10-15
  1.3 本课题设计思路与方法  15-16
第二章作用于α3β2 亚型α-芋螺毒素突变体的设计、合成  16-24
  2.1 α型芋螺毒素突变体的设计  16-17
  2.2 α型芋螺毒素突变体的合成  17-19
  2.3 多肽的分析与鉴定  19-23
  2.4 讨论  23
  2.5 本章小结  23-24
第三章 nAChR各亚基基因的克隆与表达载体的构建  24-52
  3.1 前言  24
  3.2 材料  24-25
  3.3 主要仪器  25
  3.4 方法  25-34
  3.5 结果  34-50
  3.6 讨论  50
  3.7 本章小结  50-52
第四章爪蟾卵母细胞表达体系的建立及nAChR药理学特性的研究  52-62
  4.1 前言  52
  4.2 材料  52-55
  4.3 仪器连接与设置  55-56
  4.4 方法  56-60
  4.5 操作流程  60
  4.6 结果  60-61
  4.7 讨论  61-62
第五章作用于α3β2 亚型α-芋螺毒素的镇痛活性评价  62-66
  5.1 前言  62
  5.2 材料与方法  62-63
  5.3 结果  63
  5.4 讨论  63-66
第六章 AnIB[A11G]的荧光标记及α3β2 亚型分布测定  66-70
  6.1 前言  66
  6.2 材料与方法  66-67
  6.3 结果  67-68
  6.4 讨论  68-70
结论  70-72
致谢  72-74
参考文献  74-81
附图  81-84
发表文章  84-94
个人简历  94

作用于nAChR α3β2亚型特异α-芋螺毒素的设计合成及该靶点的功能研究

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