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核酸探针电化学传感技术用于酶活性和腺苷检测的研究

作　者: 何磊良
导　师: 羊小海；王柯敏
学　校: 湖南大学
专　业: 分析化学
关键词: 电化学生物传感二茂铁核酸探针酶活性小分子金纳米颗粒
分类号: R341
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

电化学生物传感器,具有易于实现微型化、集成化、操作简单等优点,在化学、生物学基础研究、临床检验、环境监测等方面发挥着越来越重要的作用。核酸探针能够与多种目标物特异性结合,形成多种灵活的分子识别和信号转换机制。本论文基于核酸探针的特点,针对酶和生物小分子的检测,发展简便、快速、灵敏的电化学传感器,具体完成了以下研究工作：1.二茂铁核酸探针的合成及电化学表征对琥珀酰亚胺偶联方法进行改进,尽量消除水对反应体系中活性中间体的影响,并采用高效液相色谱(HPLC)纯化,得到了二茂铁标记的核酸探针。电化学测量证明二茂铁已成功标记到3’为NH2的核酸探针上。相比于一般的采用透析分离纯化二茂铁核酸探针的方法,HPLC分离纯化的二茂铁核酸探针具有纯度高、信号强等优点。为下一步的工作打下了基础。2.二茂铁核酸探针用于APE1酶活性的电化学检测APEl酶是一种重要的DNA损伤修复蛋白,经典的放射性标记活性分析虽然灵敏度高,但存在操作复杂、费时、有放射性污染等缺陷。我们在带有AP位点的核酸探针上修饰二茂铁,并与固定在金电极表面的捕获探针杂交,形成带AP位点的二茂铁修饰的双链DNA。利用APE1酶对AP位点切割产生的信号变化实现了酶活性的电化学检测。该方法对APEl酶活性的检测范围是0.02-2 U／ml,检测下限为0.02 U／ml,具有操作简单、灵敏度高等优点,有望用于生物样品中DNA损伤修复的研究。3.“裂开型”核酸适体结合金纳米颗粒信号放大用于腺苷的高灵敏检测虽然核酸适体能够实现小分子的特异性识别,但由于结合常数一般相对较低,往往需要结合信号放大技术以提高检测灵敏度。我们构建了一种基于核酸适体和金纳米颗粒信号放大的检测小分子腺苷的电化学生物传感器。该传感器对腺苷检测的线性范围为0.1pM-1nM,检测下限为0.1 pM,且特异性好,有望拓展到其他小分子的检测中。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-11
本文所用英文缩略词  11-12
第1章绪论  12-26
  1.1 核酸探针在电极表面的固定化方法  12-14
    1.1.1 吸附法  13
    1.1.2 亲和素-生物素固定法  13
    1.1.3 共价键合固定法  13-14
  1.2 基于核酸探针的电化学传感器的信号转换机制  14-18
    1.2.1 利用电活性杂交指示剂实现信号转换  14
    1.2.2 利用电活性基团标记的核酸探针实现信号转换  14-15
    1.2.3 利用酶标核酸探针实现信号转换  15-16
    1.2.4 利用纳米粒子标记的核酸探针实现信号转换  16-17
    1.2.5 利用核酸本身的电化学氧化还原活性实现信号转换  17-18
    1.2.6 利用场效应晶体管实现信号转换  18
  1.3 核酸探针电化学传感器在分析检测中的应用  18-26
    1.3.1 蛋白质的检测  18-20
    1.3.2 核酸的检测  20-21
    1.3.3 小分子的检测  21-23
    1.3.4 无机离子的检测  23-26
第2章二茂铁修饰的核酸探针的合成及电化学表征  26-37
  2.1 前言  26
  2.2 实验部分  26-30
    2.2.1 主要仪器和试剂  26-28
    2.2.2 DNA合成、分离与纯化  28-29
    2.2.3 Fc-NHS活性酯的合成及HPLC表征  29
    2.2.4 二茂铁修饰核酸探针的合成及纯化  29-30
    2.2.5 S—DNA在金电极表面的固定  30
    2.2.6 二茂铁修饰的核酸探针的电化学表征  30
  2.3 结果与讨论  30-36
    2.3.1 二茂铁修饰核酸探针的合成路线  30-31
    2.3.2 DNA的分离与纯化  31-33
    2.3.3 Fc-NHS活性酯的HPLC表征  33
    2.3.4 二茂铁核酸探针的分离纯化  33-34
    2.3.5 二茂铁核酸探针的电化学表征  34-36
  2.4 小结  36-37
第3章二茂铁核酸探针用于APE1酶活性的电化学检测  37-45
  3.1 前言  37
  3.2 实验部分  37-39
    3.2.1主要仪器和试剂  37-38
    3.2.2 茂铁标记的带有AP位点的核酸探针的合成  38
    3.2.3 金电极上S-DNA的固定及修饰密度测定  38-39
    3.2.4 金电极表面S-DNA与Fc-DNA的杂交  39
    3.2.5 不同电位扫描速度下的二茂铁峰电流的考察  39
    3.2.6 不同浓度APE1酶活性的检测  39
  3.3 结果与讨论  39-44
    3.3.1 检测原理  39-40
    3.3.2 Fc-DNA探针的合成  40
    3.3.3 电极表面DNA修饰密度的测定  40-41
    3.3.4 不同电位扫描速度下的二茂铁峰电流  41-42
    3.3.5 APE1酶活性检测的可行性分析  42-43
    3.3.6 APE1酶活性的定量检测  43-44
  3.4 小结  44-45
第4章 "裂开型"核酸适体结合金纳米颗粒信号放大用于腺苷的高灵敏检测  45-54
  4.1 前言  45
  4.2 实验部分  45-48
    4.2.1 主要仪器和试剂  45-46
    4.2.2 金纳米颗粒的制备与修饰  46-47
    4.2.3 金电极的表面处理与修饰  47
    4.2.4 金电极表面DNA修饰密度的测定  47
    4.2.5 腺苷的检测  47-48
    4.2.6 腺苷检测的特异性考察  48
    4.2.7金电极的再生  48
  4.3 结果与讨论  48-53
    4.3.1 实验原理  48-49
    4.3.2 金纳米颗粒修饰DNA前后的紫外-可见吸收光谱  49
    4.3.3 腺苷检测的可行性分析  49-50
    4.3.4 金电极表面DNA探针的固定密度  50
    4.3.5 腺苷检测的灵敏度  50-51
    4.3.6 特异性考察  51-52
    4.3.7 腺苷电化学传感界面的再生  52-53
  4.4 小结  53-54
结论  54-55
参考文献  55-64
致谢  64

核酸探针电化学传感技术用于酶活性和腺苷检测的研究

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