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蜂毒肽分离纯化与体内外抗HSV-1病毒作用研究

作　者: 张丽娟
导　师: 吴珍红
学　校: 福建农林大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 单纯疱疹病毒Ⅰ型蜂毒肽抗病毒作用作用机制
分类号: R752.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

近年来由单纯疱疹病毒I型引起的疾病发病率不断上升且伴有病毒耐药株的出现,为此我们开展了蜂毒肽抗HSV-1作用的研究。研究结果如下:利用QF-1型超级蜜蜂电子自动取毒器采集意蜂蜂毒,通过葡聚糖凝胶层析分离纯化,再进行SDS-PAGE电泳鉴定,证实其为电泳级纯度的蜂毒肽,供后续实验使用。利用非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)培养体外模型,采用细胞病变法,阿昔洛韦(ACV)作对照,探讨蜂毒肽有无体外抗HSV-1活性。结果显示,通过MTT法测得蜂毒肽对Vero细胞的半数毒性浓度(CC50)为10-2.1 mg/100μL。当利用100μL 9CC50的蜂毒肽时能够使病毒抑制率达到66.51 %。病毒的半数感染量(TCID50)为10-5.2/100μL。用HSV-1病毒建立小鼠脑炎模型,以ACV作为阳性对照物,对蜂毒肽体内抗HSV-1病毒的活性进行评估。结果显示,HSV-1病毒对小鼠的半数致死量(LD50)为10-3 mg/kg;蜂毒肽可以使染毒小鼠存活率从20 %提高到50 %,具有明显抑制HSV-1病毒的作用,并具有延长小鼠存活时间的作用。设计四组蜂毒肽抗HSV-1病毒作用靶点作为四个试验组,分别探讨蜂毒肽对HSV-1病毒的直接作用、病毒的吸附、合成及释放是否有影响。结果显示:(1)四个浓度梯度1CC50,3CC50,6CC50,9CC50的蜂毒肽对HSV-1病毒的吸附均有抑制作用,抑制率分别为31.25 %,32.92 %,32.92 %,32.08 %,其中蜂毒肽对HSV-1病毒的最高抑制率为32.92 %;(2)1CC50,3CC50,6CC50,9CC50四个浓度梯度的蜂毒肽对HSV-1病毒的合成均有抑制作用,抑制率分别为29.05 %,29.91 %,31.69 %,33.06 %,其中蜂毒肽对HSV-1病毒合成的最高抑制率为33.06 %;(3)1CC50,3CC50,6CC50,9CC50四个浓度梯度的蜂毒肽对HSV-1病毒的释放均有抑制作用,抑制率分别为29.31 %,18.37 %,13.28 %,10.70 %,其中蜂毒肽对HSV-1病毒释放的最高抑制率为29.31 %,可见蜂毒肽能够抑制HSV-1病毒的释放,但是随着蜂毒肽剂量的增加,对病毒释放的抑制率明显降低。(4)蜂毒肽对病毒直接作用的实验显示,蜂毒肽实验组与病毒对照组的细胞存活率基本相同,说明蜂毒肽没有直接杀死病毒的作用。

全文目录

摘要  9-10
ABSTRACT  10-12
第一章引言  12-25
  1 HSV 的研究进展  13-17
    1.1 HSV 病原学  13-14
    1.2 流行病学及临床表现  14-15
    1.3 HSV 发病机制  15-17
      1.3.1 HSV 的增殖性感染  15-16
      1.3.2 HSV 的潜伏性感染  16-17
    1.4 抗HSV 药物的研究  17
  2 蜂毒肽的研究进展  17-25
    2.1 蜂毒肽的结构  18-19
    2.2 蜂毒肽的药理作用  19-23
      2.2.1 抗辐射作用  19-20
      2.2.2 抗菌作用  20
      2.2.3 抗肿瘤作用  20-21
      2.2.4 抗炎镇痛作用  21-22
      2.2.5 抗艾滋病毒作用  22
      2.2.6 对血液及心血管系统的作用  22-23
      2.2.7 对免疫及消化系统的作用  23
    2.3 蜂毒肽的获得  23-25
第二章蜂毒肽的分离纯化与鉴定  25-36
  1 材料  25-26
    1.1 药品与试剂  25
    1.2 主要仪器  25-26
  2 方法  26-32
    2.1 意蜂蜂毒的采集  26-27
    2.2 流动相的配制  27
    2.3 色谱柱的装填  27
    2.4 蜂毒的提纯  27-28
    2.5 蜂毒肽的分离  28-30
      2.5.1 溶血活性鉴定  28
      2.5.2 蜂毒葡聚糖凝胶层析  28-30
    2.6 SDS-PAGE 凝胶电泳鉴定  30-32
      2.6.1 相关溶液的配制  30-31
      2.6.2 凝胶的配制  31
      2.6.3 凝胶的灌制  31-32
      2.6.4 样品的处理  32
      2.6.5 电泳  32
      2.6.6 染色及脱色  32
  3 结果与分析  32-34
    3.1 层析结果  32-34
      3.1.1 Sephadex G-25 层析结果  32-33
      3.1.2 Sephadex G-50 层析结果  33
      3.1.3 Sephadex G-75 层析结果  33-34
    3.2 电泳结果  34
  4 讨论  34-36
第三章蜂毒肽体内外抗HSV-1 研究  36-47
  1 材料  36-38
    1.1 药品与试剂  36-37
      1.1.1 药品  36
      1.1.2 相关试剂的配制  36-37
      1.1.3 细胞、病毒株与小鼠  37
    1.2 主要实验仪器  37-38
  2 方法  38-42
    2.1 病毒滴度的测定  38-40
      2.1.1 细胞的复苏与传代  38-39
      2.1.2 细胞计数  39
      2.1.3 细胞冻存  39
      2.1.4 病毒对细胞半数感染量的测定  39-40
    2.2 MTT 法测药物对细胞的毒性  40-41
    2.3 蜂毒肽体外抗HSV-1 的实验  41
    2.4 蜂毒肽的体内抗HSV-1 实验  41-42
      2.4.1 病毒LD50 的测定  41-42
      2.4.2 蜂毒肽对小鼠毒性的测定  42
      2.4.3 蜂毒肽对染毒小鼠作用的实验  42
  3 结果与分析  42-46
    3.1 病毒滴度TCID50  42-43
    3.2 蜂毒肽对细胞的毒性  43
    3.3 蜂毒肽对HSV-1 的体外抑制作用  43-44
    3.4 蜂毒肽对染毒小鼠生存率与平均生存时间的影响  44-46
  4 讨论  46-47
第四章蜂毒肽抗HSV-1 作用机理的研究  47-55
  1 材料  47-49
    1.1 药品与试剂  47-48
      1.1.1 药品  47
      1.1.2 相关试剂的配制  47-48
      1.1.3 细胞、病毒株与小鼠  48
    1.2 主要实验仪器  48-49
  2 方法  49-51
    2.1 蜂毒肽对病毒的直接作用实验  49
    2.2 蜂毒肽对病毒吸附的影响实验  49-50
    2.3 蜂毒肽对病毒生物合成的影响试验  50
    2.4 蜂毒肽对病毒释放的影响实验  50-51
  3 结果与分析  51-53
    3.1 蜂毒肽与病毒直接作用的结果  51
    3.2 蜂毒肽对病毒吸附的抑制  51-52
    3.3 蜂毒肽对病毒合成的抑制  52-53
    3.4 蜂毒肽对病毒释放的抑制  53
  4 讨论  53-55
参考文献  55-61
致谢  61

蜂毒肽分离纯化与体内外抗HSV-1病毒作用研究

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