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PPARγ基因修饰对非酒精性脂肪性肝纤维化的防治机制

作　者: 韩芳
导　师: 南月敏
学　校: 河北医科大学
专　业: 内科学
关键词: 小鼠非酒精性脂肪性肝纤维化过氧化物增殖酶体激活物受体γ 罗格列酮 GW9662 Ad-PPARγ
分类号: R575.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的:非酒性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是代谢综合征的重要危险因素之一,主要包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化和肝硬化等一系列病变过程。非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)是NAFLD病变过程的重要阶段,以肝细胞脂肪变性伴有坏死性炎症为主要特征,进一步进展可导致肝纤维化和肝硬化,近年研究证实NASH亦是肝细胞癌的致病因素之一。过氧化物增殖酶体激活物受体γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma, PPARγ)为核激素受体超家族成员,是促脂肪细胞分化的细胞核转录因子之一,其经配体激活后调节体内糖、脂代谢,对细胞生长、分化、炎症及凋亡有重要影响。肝脏发生脂肪变时,胰岛素抵抗的程度随脂肪性肝炎及纤维化的发展逐渐加重,PPARγ的外源性调节可能有助于改善糖和脂肪代谢,延缓或阻止脂肪性肝炎、肝纤维化的发生及进展。本研究旨在探讨选择性的PPARγ基因导入治疗和PPARγ激动剂在非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化中的靶向性治疗效果,为临床有效防治非酒性脂肪性肝炎、肝纤维化提供新的途径和理论依据。方法:采用高脂、胆碱-蛋氨酸缺乏饮食(high fat, methionine and choline deficient diet, MCD)建立小鼠非酒精性脂肪性肝纤维化模型,分别应用PPARγ拮抗剂、激动剂及/或腺病毒载体PPARγ基因导入(Ad-PPARγ)及β-半乳糖苷酶转基因腺病毒(Ad-LacZ)进行干预实验,并以胆碱-蛋氨酸充足饮食设立对照组。血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)及甘油三酯(triglyceride, TG)采用日本Olympus AU 2700全自动生化分析仪酶法测定。肝组织切片采用HE染色观察肝脂肪变、炎症活动及纤维化程度;Masson染色观察肝脏纤维化程度。PPARγ、转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1,TGFβ1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及间质金属蛋白酶-2(Matrix Metalloproteinase-2, MMP-2)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)mRNA和蛋白表达分别采用RT-PCR、western blot及免疫组织化学检测。实验结果采用SPSS13.0单因素方差分析进行统计学处理,组间比较采用Student- Newman-Keuls分析。结果:MCD饮食小鼠可形成典型脂肪性肝纤维化模型,PPARγ激动剂及/或腺病毒载体基因导入可显著改善肝细胞脂肪变性、坏死性炎症及纤维化程度,尤以PPARγ激动剂联合腺病毒载体PPARγ基因导入组为著。反之,PPARγ拮抗剂GW9662则加重肝细胞脂变、炎症坏死及肝纤维化程度。TGFβ1、α-SMA、MMP-2及TNF-αmRNA及蛋白表达随PPARγ表达增强及肝脏纤维化程度的减轻而改善(P<0.05)。1实验动物一般情况对照组小鼠活泼、毛发有光泽,体重及肝重随造模时间逐渐增加,模型组及干预组小鼠体重及肝重则明显降低(P<0.05),各组间肝指数并无显著差异(P>0.05)(Table2)。2实验小鼠血清生化学改变MCD组、Ad-LacZ组血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)水平与对照组相比显著升高,罗格列酮组、Ad-PPARγ组及罗格列酮与Ad-PPARγ联合组ALT水平较模型组降低,尤以联合治疗组为著;PPARγ阻滞剂GW9662组ALT水平高于模型组。模型组及各干预组血清甘油三酯(triglyceride, TG)水平均显著高于对照组,P<0.05。3实验小鼠肝组织病理学变化肝组织切片HE及Masson染色显示,MCD饮食喂养小鼠及Ad-LacZ基因导入小鼠可见重度肝细胞大泡性脂肪变性、炎细胞浸润、纤维化形成。罗格列酮组、Ad-PPARγ组及罗格列酮与Ad-PPARγ联合组肝细胞脂肪变、炎症及纤维化均明显减轻,尤以罗格列酮与Ad-PPARγ联合组肝损伤改善明显。GW9662组小鼠上述肝损伤较模型组加重(Fig.1,Fig.2)。4 PPARγ基因调控对肝内促炎及促纤维化因子表达的作用MCD饮食喂养小鼠PPARγmRNA及蛋白的表达显著低于对照组(P<0.05);应用PPARγ激动剂罗格列酮及Ad- PPARγ导入后,小鼠肝组织PPARγmRNA及蛋白的表达显著增强,尤其联合应用罗格列酮及Ad-PPARγ导入组明显,伴随炎症因子TNF-α、促纤维化形成因子α-SMA,TGFβ1,MMP-2的表达下调。而PPARγ阻滞剂GW9662干预组呈现相反趋势。肝组织切片免疫组织化学染色显示:TNF-α、α-SMA,TGFβ1及MMP-2表达与western blot呈一致趋势,TNF-α主要表达于炎症活动区的肝窦壁细胞及炎细胞;TGFβ1、MMP2及α-SMA主要表达于炎症及纤维化明显区域,TGFβ1主要表达于星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)及Kupffer细胞胞浆,MMP-2主要表达于纤维间隔内及汇管区的间质细胞胞浆,α-SMA主要表达于肝窦周隙HSCs胞浆,并与肝纤维化程度密切相关。结论:PPARγ是调节肝脏脂质代谢、炎症及纤维化形成的关键因子,PPARγ靶向激活或基因导入可显著改善MCD饮食诱导的肝损伤,包括肝脂肪变、炎症和肝纤维化,提示PPARγ靶向基因调控可能为非酒精性脂肪性肝纤维化的治疗策略之一。

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-10
研究论文 PPARγ基因修饰对非酒精性脂肪性肝纤维化的防治机制  10-36
  前言  10-11
  材料与方法  11-18
  结果  18-22
  附图  22-27
  附表  27-30
  讨论  30-33
  结论  33-34
  参考文献  34-36
综述 PPARγ在非酒精性脂肪性肝病发病机制中的作用  36-45
致谢  45-46
个人简历  46

PPARγ基因修饰对非酒精性脂肪性肝纤维化的防治机制

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