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基因芯片筛选成年男性精子活力不足分子标记物

作　者: 周其赵
导　师: 毛向明
学　校: 南方医科大学
专　业: 泌尿外科
关键词: 精子密度梯度离心精子RNA 精子活力基因表达基因芯片
分类号: R698.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

弱精子症(又称精子活力不足)是导致男性不育的常见原因之一。然而,弱精子症病因复杂,发病机制仍能不清,严重阻碍了弱精子症临床治疗的进展。近年来对弱精子症的研究取得了一定进展,一些基因(如Tektin-2、DNAI1、DNAH5、DNAH11)被证实与弱精子症的发生有关；此外,研究发现,在同一份正常的精液样本中,一些基因(如Prm1、Aromatase、ENOS和NNOS)在低活力精子中的表达明显低于高活力精子。这些研究告诉我们精子中mRNA的表达与分子生物学的进一步研究对阐述精子的功能有非常重要的意义。本研究采用人类全基因组基因芯片获取精子活力不足与精子活力正常男性精液中精子的基因表达谱；筛选在成年男性精子活力不足精子中差异表达的基因,并探讨这些基因的功能及其在精子中的意义。本研究的主要研究方法、内容和结论包括以下几个方面：第1部分成年男性精子活力不足与精子活力正常样本的选择与收集目的：收集成年男性精子活力不足与精子活力正常的精液样本,50%1层Percoll,90%和45%2层Percoll密度梯度离心方法分别分离、纯化精子,探讨哪种分离方法更适合本课题的研究。方法：1.按照WHO的诊断标准,选择经连续至少3次精液常规检查都诊断为精子活力不足的精液样本及本次精液常规检查正常的精液样本;同时采用Diff-Quick染色方法评价精子的形态；所有患者均排除畸形精子症,液化异常、泌尿系感染、附睾或睾丸炎及系统性疾病病史,专科体格检查均正常；所有选择的标本都告知患者,并获取其知情同意。2.对收集的10份精液样本,分别采用50%1层Percoll,90%和45%2层Percoll密度梯度离心方法分离纯化精子,分离前后分别应用SCA (Sperm Class Analyzer)精子质量分析仪分析精子密度、活力、动态参数和圆形细胞密度。结果：1.收集到精子活力不足和精子活力正常的样本分别为120和160例；2.1层法分离后精子回收率为(56.9±10.3)%,明显高于2层法(P=0.004,P<0.01)；1层和2层法分离后A级精子百分率明显高于分离前(P=0.016,P<0.05；P=0.001,P<0.01)；1层法分离精子后C级精子百分率明显高于2层法(P=0.021,P<0.05),与分离前相比没有明显差异(P=0.838,P>0.05)；2层法分离后A+B级精子百分率明显高于分离前(P=0.037,P<0.05),1层法分离后A+B级精子百分率与分离前相比没有明显差异(P=0.677,P>0.05)；1层和2层法分离后圆形细胞密度明显低于分离前(P=0.002,P<0.01；P=0.000,P<0.01),两种方法之间没有差异(P=0.414,P>0.05)。结论：1.收集的研究样本数量可以保障后续实验对样本的需求；2.1层法分离后精子的回收率较高,分离后的精子活力较处理前变化不大,能够较好的反映精子分离前的水平,用于精子活力方面的科学研究更能反映实际情况。因此,对符合条件的精液样本,我们采用50%的1层Percoll密度梯度离心方法进行分离,纯化。第2部分精子RNA的提取、检测和分析目的：采用Qiagen公司的RNeasy mini kit试剂盒提取精子RNA,采用Agilent 2100 Bioanalyzer分析精子RNA的种类,建立一套完整的精子RNA提取、检测方法。方法：1.将收集的精子标本从-80℃冰箱中取出,37℃水欲箱解冻,每四份合为一份,采用RNeasy mini kit提取精子RNA；2.提取的精子RNA通过紫外分光光度计检测,测定RNA的浓度和纯度；同时将提取的精子RNA通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳及Agilent 2100 Bioanalyzer分析,检测RNA的完整性。结果：1.紫外分光光度计测量发现精子RNA的总量为5ug左右,A260／A280比值均大于2.0,表明提取的精子RNA纯度较高；2.1.5%琼脂糖凝胶电泳没有发现28S和18S条带,可以看到一些片状的白色区域；3. Agilent 2100 Bioanalyzer发现精子中含有大量小分子量RNA,代表的正是片段状的mRNA。结论：1.结果表明我们建立了一套完整的精子RNA的提取、检测方法；2.分析发现精子中含有大量小分子量的RNA；所提取的精子RNA纯度较高,浓度可,可为后续试验提供精子RNA样本保障。第3部分精子活力不足分子标记物的筛选、验证及分析目的：采用Agilent human 4×44K基因芯片筛选在精子活力不足精子中差异表达的基因,应用生物信息学对其做初步分析。方法：1.对检测合格的总RNA采用Ambion MessageAmpⅡcRNA Amplification Kit试剂盒体外转录制备cRNA;逆转录标记cRN A,纯化后与Agilent human4×44K芯片杂交,杂交信号经扫描后,Feature Extraction软件对扫描结果进行处理；2.并用PANTHER在线分析工具对差异表达的基因进行初步分析；3. Real-time PCR对芯片检测结果进行验证；结果：1.按照基因表达上调或下调2倍以上并且两组样本T检验p<0.05的筛选标准,在含有41000个基因的芯片中,从精子活力不足患者中筛选出1265个差异表达的基因,其中307个基因表达上调,958个基因表达下调；2. PANTHER在线分析发现精子中的mRNAs可能具有一系列的细胞功能和参与了多种生物学过程；其中一部分基因被发现与精子发生和精子活力相关,如ZFP90, PKDREJ, CRISP2, SEMG1和SPAG6;3. Real-time PCR试验证实ZFP90, C14ORF140和SEMG1基因的表达水平与芯片的结果基本一致。结论：1.精子活力与精子mRNAs的表达水平有密切关系；2.精子中的mRNAs可能有一系列的细胞功能,并参与了各种生物学过程;3.筛选出的具有特征性的和新发现的差异表达基因可能会成为潜在的诊断标记物,这些基因的进一步功能研究可能会帮助我们阐述弱精子症的相关发病机制。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-15
前言  15-21
  1、国内外研究现状  16-18
  2、本研究的目的  18
  3、主要工作内容  18
  4、创新性  18
  5、参考文献  18-21
第1部分成年男性精子活力不足与精子活力正常样本的选择与收集  21-29
  1、材料和方法  21-23
  2、结果  23-25
  3、讨论  25-26
  4、小结  26-27
  5、参考文献  27-29
第2部分精子RNA的提取、检测和分析  29-37
  1、材料和方法  29-32
  2、结果  32-34
  3、讨论  34-35
  4、小结  35-36
  5、参考文献  36-37
第3部分精子活力不足分子标记物的筛选、验证及分析  37-54
  1、材料和方法  38-43
  2、结果  43-47
  3、讨论  47-50
  4、小结  50-51
  5、参考文献  51-54
全文总结  54-56
  1 小结  54-55
  2 创新点  55
  3 存在的问题  55
  4 后续的工作  55-56
综述  56-65
缩略词表  65-66
硕士期间发表和待发表的文章  66-67
致谢  67-69
统计学证明  69

基因芯片筛选成年男性精子活力不足分子标记物

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