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泛素连接酶（E3）gp78的RNA干扰对MHCC97-H细胞生物学行为及KAI1表达的影响

作　者: 李楠
导　师: 陈文生
学　校: 第三军医大学
专　业: 内科学
关键词: 肝细胞癌 gp78 KAI1 MHCC97-H
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 45次
引　用: 1次
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内容摘要


研究背景及目的肝癌是导致人类死亡率第二高的恶性肿瘤,尤其是其肝外转移,更是临床肝癌治疗的难点。肝癌细胞通常早期经过血道转移至邻近或远处的组织器官,因此肝癌细胞具有很强的转移侵袭能力,而这种转移侵袭行为的发生机制则十分复杂。越来越多的研究认为,肿瘤细胞迁移和侵袭能力的增强,是肿瘤发生转移的重要机制之一。先前在动物细胞株进行的研究已经表明,gp78,作为一种与内质网相关性蛋白降解途径（ERAD）相关的泛素连接酶（E3）,其过表达诱导了肿瘤细胞表型的变化,而这种变化却增强了细胞的存活能力和增殖能力,细胞的侵袭潜力和活动能力也有所增强。最近有研究报道,肿瘤组织中gp78 mRNA水平表达较邻近正常组织有显著增高,并且有研究表明,肿瘤转移抑制因子KAI1是gp78的特异性作用底物,gp78的E3酶活性可以通过对骨肉瘤细胞中肿瘤转移抑制因子KAI1的降解来促进骨肉瘤的转移。但是在肝细胞癌的转移侵袭过程当中,gp78所发挥的作用现在还不太明了,尤其是在体外gp78对肝癌细胞的生物学特性的影响仍不清楚。在本研究中,我们假设肝癌细胞中gp78表达减少可能导致KAI1表达水平的增高,从而使肿瘤细胞增殖、形成克隆以及迁移和侵袭能力的下降,进而推断可能减弱肝癌的转移能力。为了验证这个假设,我们运用RNAi技术沉默肝癌细胞MHCC97-H中gp78的表达,检测gp78沉默前后肝癌细胞增殖、迁移及侵袭等生物学活性的变化,同时也检测了gp78沉默前后肝癌细胞中KAI1的表达。研究方法1、根据gp78基因序列( GeneBank NM001144,通过www.genscript.com网站在线siRNA设计工具,设计三对siRNA,定向插入到质粒pRNAT-U6.1/Neo,抽提质粒并测序鉴定。构建好的三种gp78干扰载体分别命名为pRNAi-1, pRNAi-2与pRNAi-3。将细胞接种于6孔板,待细胞融合率达80%90%时,用脂质体介导的基因转染方法将构建好的gp78干扰载体与空载体转入MHCC97-H细胞,经G418筛选出稳定转染的细胞系。2、采用不同的实验技术检测gp78 RNAi前后MHCC97-H细胞增殖能力、克隆形成能力、迁移能力和侵袭能力的变化。3、运用RT-PCR与Western Blot法检测gp78 RNAi前后MHCC97-H细胞中gp78与KAI1的表达。结果1、构建的干扰重组载体经测序比对,插入的寡核苷酸序列与设计的靶点序列完全吻合,说明干扰重组载体构建成功,经过G418筛选和克隆挑选,获得稳定转染的细胞株,转染细胞在激光共聚焦显微镜下可发出绿色荧光。2、3种siRNA真核表达质粒有两种可以有效抑制gp78的表达,其中以pRNAi-2作用效果最为明显。3、MTT实验表明干扰组细胞增殖能力明显低于MHCC97-H组和空载体组细胞;平板克隆形成实验表明干扰组单个细胞形成克隆的能力与MHCC97-H组和空载体组细胞相比显著降低;细胞划痕愈合实验表明干扰组细胞迁移能力明显低于MHCC97-H组和空载体组细胞;Transwell侵袭小室实验表明干扰组细胞侵袭能力与MHCC97-H组和空载体组细胞相比显著降低;4、运用RT-PCR与Western Blot检测,干扰组细胞的KAI1表达高于MHCC97-H和空载体组细胞。结论gp78特异性RNA干扰能有效抑制MHCC97-H细胞中gp78的表达,并上调了KAI1基因的表达,从而间接降低了肝癌细胞的增殖、克隆形成、迁移以及侵袭的能力,进而有可能减弱了肝癌细胞的转移能力,逆转肝癌细胞的恶性表型。

全文目录


英文缩写一览表  4-6
英文摘要  6-9
中文摘要  9-11
论文正文 泛素连接酶(E3)gp78 的 RNA 干扰对 MHCC97-H 细胞生物学行为及 KA11 表达的影响  11-64
  前言  11-13
  第一部分 泛素连接酶(E3)gp78 RNAi 真核表达载体的构建及鉴定  13-42
    实验材料  13-30
    结果  30-39
    讨论  39-42
  第二部分 gp78 RNAi 对MHCC97-H 细胞生物学行为的影响  42-52
    实验材料  42-43
    实验方法  43-46
    结果  46-50
    讨论  50-52
  第三部分 MHCC97-H 细胞株中gp78 的RNA 干扰对KA11 表达的影响  52-59
    实验材料  52
    实验方法  52-53
    结果  53-57
    讨论  57-59
  全文结论  59-60
  致谢  60-61
  参考文献  61-64
文献综述 泛素连接酶(E3)gp78 在恶性肿瘤中的研究进展  64-73
  参考文献  70-73
在读期间发表的文章  73

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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