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杜氏利什曼原虫(Leishania donovani,L.d)是一种专性细胞内寄生的鞭毛虫,可感染人、哺乳动物和爬行动物等,引起人畜共患的利什曼原虫病(Leishmaniasis)又称黑热病。该病呈世界范围流行,目前全世界黑热病患者超过1200万,另外有3.67亿人面临着感染威胁。20世纪50年代,黑热病曾在我国长江以北地区广泛流行,是我国人群中五大寄生虫病之一。传统治疗药物有多价锑类化合物、喷他脒和两性霉素B等,然而近年来对多价锑剂的耐药性日益严重,极大的限制了它们的应用,另外,两性霉素B常导致中毒性肾损害、过敏反应、低血钾、发热和心脏毒性等,而喷他脒又存在疗程长、复发率高、用药不方便等缺陷。因此,研究一种新的抗黑热病药物已经迫在眉睫。硝唑尼特(Nitazoxanide,NTZ)是一种硝噻柳酸酰胺的衍生物。由Romark实验室于1976年首次报道,化学名称为苯酚乙酸酯。2002年美国FDA批准其液体制剂用于治疗隐孢子虫病和由肠贾第鞭毛虫所致1～11岁的儿童腹泻。另外,大量实验研究表明其不但有抗多种寄生虫活性,同时还具有抗细菌、抗病毒活性,目前,NTZ用于治疗艰难梭状芽胞杆菌的相关疾病、轮状病毒引起的胃肠炎和丙型肝炎已经进入临床研究阶段。但至今尚未见其用于杜氏利什曼原虫的研究报道,而且对于NTZ的毒理学研究公开报道较少,因此,我们选用硝唑尼特对L.d进行药效活性试验,以观察该药对L.d的驱杀效果,同时进行了硝唑尼特的一般毒性研究,以初步评价其安全性,为该药的临床应用奠定基础。体外试验应用镜下观察和四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法,检测六个剂量组(200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL和6.25μg/mL)的NTZ分别作用48h和72h后对L.d前鞭毛体的药效活性,以3μg/mL的两性霉素B为阳性对照组,阴性对照组加入等量药物溶剂DMSO,空白对照组不做任何处理。结果显示,药物作用48h后,以镜下观察和MTT比色法检测上述各浓度NTZ的抑虫率分别为95.85%、87.17%、66.81%、53.10%、42.45%、28.13%和94.81%、87.23%、59.26%、45.98%、38.80%、25.14%,与阴性对照组(1.12%和0.97%)比较有显著差异(P<0.05),另外,200μg/mL药物组的抑虫率与阳性对照组(99.81%和99.87%)比较无显著差异(P>0.05)；硝唑尼特作用72h后两种方法检测的各浓度药物抑虫率均有一定的提高,分别为98.69%、90.52%、73.56%、54.74%、45.86%、31.22%和98.75%、91.08%、68.53%、55.79%、42.67%、31.80%,与阴性对照组(1.76%和1.62%)比较有显著差异(P<0.05),同样200μg/mL药物组与阳性对照组作用效果相似,与其抑虫率(99.95%和99.96%)无显著性差异(P>0.05)。同时,本试验采用姬母萨染色实验和电镜实验观察了药物对虫体形态结构的影响,结果,200μg/mL硝唑尼特作用72h后,吉姆萨染色可见L.d前鞭毛体严重变形,有部分变成虫体碎片,鞭毛脱落,细胞质内出现空泡,核消失,动基体不完整,与阳性对照组相似；100μg/mL和50μg/mLNTZ组的虫体出现鞭毛脱落,动基体不完整,胞膜不清晰；而空白对照组和阴性对照组虫体形态基本无变化,均呈长梭形,并排成菊花状,胞膜、核、动基体、鞭毛完整、清晰。电镜下观察,可见药物试验组虫体细胞基质紊乱,有凝聚块,细胞核基质出现空斑,部分细胞核膜破裂,线粒体膜消失；空白对照组与阴性对照组虫体结构完整、核清晰。体内试验应用有限稀释法、荧光定量PCR法和肝组织病理切片检测三个剂量组(400mg/mL、200mg/mL和100mg/mL) NTZ对感染L.d小鼠的保护效果,试验结果表明,与阴性对照组比较400mg/kg/d的NTZ连续治疗10d能明显减少攻虫小鼠肝、脾内的虫体负荷,减虫率均大于90%,200mg/kg、100mg/kg药物组同样表现出一定的抑虫效果,并且呈现剂量效应相关性。各组小鼠肝脏的HE染色结果显示,400mg/kg/d的NTZ对小鼠肝脏具有很好的保护效果,能明显减少肝细胞坏死、肿胀和胞核崩解,与阳性对照组比较仅表现出汇管区静脉轻度充血和少量蛋白样物质析出。另外,本试验建立了利什曼原虫的荧光定量PCR检测方法,该方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、自动化程度高等优点,此方法可为黑热病的实时监控和防治提供非常有效的检测技术手段。硝唑尼特一般毒性试验按照农业部《新兽药一般毒性试验技术要求》进行。小鼠经口灌服中毒剂量的硝唑尼特后,出现活动减弱,被毛湿润,精神萎靡,有的阵发性抽搐,有的呈游泳状缓慢爬行,部分小鼠出现腹泻,食欲减低,体重减轻,死亡时间多在给药后1d至3d内,死亡动物无性别差异,剖检发现腹腔粘膜呈土黄色,肠壁变薄,肠管内有褐色水样液体,呈出血和坏死性肠炎病变,存活动物在2d至6d后逐渐恢复正常。灌服溶剂玉米油的小鼠生长良好。经计算,NTZ对小鼠口服LD50为6.295g/kg,95%可信限为4.889～8.105g/kg；蓄积毒性试验表明,硝唑尼特属弱蓄积或者基本无蓄积毒性,蓄积系数K>5.26；耐受性试验表明,硝唑尼特耐受性良好。综上所述,硝唑尼特在试验药物浓度下对杜氏利什曼原虫具有很强的抑制和杀灭作用,杀虫效果与剂量呈正相关,对感染杜氏利什曼原虫的小鼠具有很好的保护作用,对试验动物毒性低,无蓄积毒性,耐受性良好。
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