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叶酸介导硫酸长春碱纳米靶向制剂的制备及体外功能分析

作　者: 张俞
导　师: 祖元刚
学　校: 东北林业大学
专　业: 植物学
关键词: VBLS 纳米粒 PC-3细胞靶向性活性
分类号: TQ461
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

长春碱是从夹竹桃科植物长春花(Catharanthus roseus)中分离得到的一种具有抗癌活性的生物碱。从70年代起,长春碱开始被应用于临床治疗肿瘤,主要用于治疗何杰金氏病、乳腺癌、非小细胞性肺癌等。临床上应用的长春碱被制成硫酸长春碱(vinblastine sulfate, VBLS)注射剂,水溶性虽然有所改善,但是仍然存在着半衰期短,神经系统和胃肠道系统毒性强的缺点。应用于研究生命现象的纳米技术被称为纳米生物技术,它是纳米技术和生物学的结合。纳米材料因其粒径的改变而获得一系列特性,如量子尺寸效应、小尺寸效应、表面和界面效应。纳米微粒的尺寸一般比生物体内的细胞小得多,这就为生物学研究提供了一个新的研究途径。纳米药物载体是目前纳米生物技术的重要研究领域,主要应用于抗肿瘤等药物的靶向或局部给药制剂。本课题利用纳米生物技术改造VBLS,在降低其毒副作用的同时,增加药物靶向性、提高生物利用度,使VBLS成为更有效的抗癌药物。本课题针对VBLS临床应用毒副作用大,无靶向性的缺点,利用去溶剂法制备VBLS纳米靶向注射制剂。课题内容包括利用中心点试验设计法(Central Composite Designs, CCD)优化牛血清白蛋白(BSA)制备纳米粒工艺,运用微观检测手段检测白蛋白纳米粒(BSANP)的各项物理特性,并研究了叶酸-白蛋白-硫酸长春碱(FA-BSANP-VBLS)靶向制剂体外释放性质及稳定性。通过体外PC-3癌细胞系MTT实验和细胞凋亡实验对纳米靶向注射制剂做功能分析。以此获得具有优良稳定性、高生物利用度、肿瘤靶向性的VBLS纳米注射制剂及其相应的制备工艺和质量控制标准。本研究得出：1.制备粒径为150 nm BSANP的最优实验条件为：BSA浓度3.21 mg/mL,乙醇加入速率2.96 mL/min,乙醇量4.23 mL,交联度20%。得到的BSANP表面活性氨基数为668.973nmol/mg。原子力显微镜(Atomic Force Microscope, AFM)观察发现得到的BSANP形状规则,粒径与激光粒度仪测定结果相符合。2.在一定程度上可以通过控制加入交联剂戊二醛的量来控制BSANP表面剩余活性氨基数量,从而控制偶联上的叶酸量。在用本实验中优化得到的BSANP制备FA-BSANP时,有383.996μmol叶酸偶联到BSANP上。3.用三组粒径不同的FA-BSANP和不同比例的VBLS:FA-BSANP做实验发现,粒径越大,包封率和载药量越大。在粒径相同时,随着VBLS:FA-BSANP比例的增加,包封率和载药量也增加。粒径为156.6 nm时(优化组),最大包封率和载药量分别为86.93%和44.24%。4.添加甘露醇的FA-BSANP-VBLS冻干粉用去离子水复溶后放于4℃储存,48 h后可见溶液稳定,无分层或浑浊现象。5.FA-BSANP-VBLS在最初的12h内药物传递系统出现突释,之后缓慢释放至56 h,分别释放出所含VBLS的30%和80%。软件拟合发现该药物传递系统符合一级释放动力模型,更进一步证明了FA-BSANP-VBLS的缓释特性。6.FA-BSANP-VBLS的抗癌活性实验VBLS原药组、FA-BSANP-VBLS组和BSANP-VBLS组相比,FA-BSANP-VBLS组细胞凋亡率最高,且BSANP-VBLS组和FA-BSANP-VBLS组细胞凋亡图上均有缓释特征。通过以上实验结果,证明本实验所制备的FA-BSAN-VBLS粒径大小达到纳米级别,粒径分布均匀,形状规整,并且抗癌活性明显提高,为进一步探索该载药系统在体内的靶向性、活性和代谢规律提供了前期实验基础。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
1 绪论  10-18
  1.1 引言  10
  1.2 VBLS文献综述  10-12
    1.2.1 VBLS分子式及结构式  10-11
    1.2.2 VBLS理化性质  11
    1.2.3 VBLS抗癌机制  11
    1.2.4 长春碱类抗癌药纳米制剂综述  11-12
  1.3 白蛋白作为药物载体文献综述  12-13
  1.4 癌症靶向配体文献综述  13-15
    1.4.1 非专一性细胞增值靶向配体  13-14
    1.4.2 抗体作为靶向配体  14
    1.4.3 靶向血管生成因子的配体  14-15
    1.4.4 其它靶向配体  15
  1.5 纳米药物传递系统研究现状  15-16
    1.5.1 纳米药物传递的概念  15
    1.5.2 纳米药物传递的优势和前景  15
    1.5.3 纳米药物传递存在的问题  15-16
  1.6 课题的提出及研究意义  16
    1.6.1 课题的题出  16
    1.6.2 课题研究的意义  16
  1.7 课题的研究内容及技术路线  16-18
    1.7.1 课题研究内容  16-17
    1.7.2 课题研究的技术路线  17-18
2 BSANP的制备、优化和表征  18-27
  2.1 实验仪器与试剂  18
    2.1.1 实验仪器  18
    2.1.2 材料和试剂  18
  2.2 BSANP的制备  18
  2.3 BSANP的表征  18
    2.3.1 BSANP纳米粒粒径检测  18
    2.3.2 表面活性氨基酸残基测定  18
    2.3.3 原子力显微镜观察BSANP形貌  18
  2.4 利用响应面软件优化影响制备过程的参数  18-19
  2.5 实验结果与讨论  19-26
    2.5.1 中心点实验设计对BSANP制备过程的优化分析  19-25
    2.5.2 BSANP的表征  25-26
  2.6 本章小结  26-27
3 FA-BSANP-BLS的制备及表征  27-35
  3.1 实验仪器与试剂  27
    3.1.1 实验仪器  27
    3.1.2 材料和试剂  27
  3.2 FA偶联BSANP的制备  27-28
    3.2.1 叶酸活性酯的制备  27
    3.2.2 FA-BSANP的偶联  27
    3.2.3 FA偶联量的测定  27-28
  3.3 FA-BSANP-VBLS的制备  28
    3.3.1 VBLS的吸附交联法载药  28
    3.3.2 包封率和载药量的测定  28
    3.3.3 纳米粒粒径对包封率和载药量的影响  28
  3.4 FA-BSANP-VBLS的形貌表征和稳定性评价  28-29
    3.4.1 FA-BSANP-VBLS的形貌  28
    3.4.2 FA-BSANP-VBLS的储存稳定性  28-29
  3.5 实验结果与讨论  29-34
    3.5.1 FA偶联量的测定  29-30
    3.5.2 包封率和载药量  30-32
    3.5.3 FA-BSANP-VBLS的形貌和稳定性  32-34
  3.6 本章小结  34-35
4 FA-BSANP-VBLS的体外释放及抗癌活性实验  35-40
  4.1 实验仪器与试剂  35
    4.1.1 实验仪器  35
    4.1.2 材料和试剂  35
  4.2 FA-BSANP-VBLS的体外释放实验  35
  4.3 FA-BSANP-VBLS的抗癌活性实验  35-36
    4.3.1 PC-3癌细胞系的培养  35-36
    4.3.2 细胞凋亡实验  36
  4.4 实验结果与讨论  36-39
    4.4.1 FA-BSANP-VBLS的体外释放实验  36-37
    4.4.2 细胞凋亡实验  37-39
  4.5 本章小结  39-40
结论  40-41
参考文献  41-46
攻读学位期间发表的学术论文  46-47
致谢  47-48

叶酸介导硫酸长春碱纳米靶向制剂的制备及体外功能分析

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