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赤霉素氧化酶基因GA2ox1的克隆、原核表达及纯化

作　者: 常丽
导　师: 刘选明
学　校: 湖南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 拟南芥 GA2ox1基因 生物信息学 原核表达 纯化 Western Blot
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 175次
引　用: 1次
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内容摘要


赤霉素(gibberellin, GA)是一类四环二萜羧酸,是种类最多、生理功能最广的植物内源激素之一。目前,已发现的赤霉素类物质有136种,其中只有少数具有生物活性,影响着高等植物生活史的各个阶段。随着研究手段和技术的飞速发展,各种突变体材料的获得和利用,在GA生物合成及其调控方面,特别是GA合成中关键酶基因的克隆成功及对其功能的研究取得了较大的进展。GA2-氧化酶是由多基因编码的双加氧酶,调节赤霉素代谢,作用于有生物活性的GA1和GA4,将其转变成无活性的GA8和GA34,使植物体内GAs的活性降低,呈现矮化、节间缩短的表型。此外,GA2-氧化酶还参与植物光形态的建成。光通过诱导GA2-氧化酶基因的表达,使植物体内有生物活性的GA4降低而促进光形态建成。但目前仍没有关于GA2-氧化酶抗体的报道。因此,本论文通过生物信息学预测分析GA2ox1基因编码蛋白质的基本性质,从拟南芥基因组中克隆GA2ox1基因,构建高效原核表达载体pDEST17-GA2ox1,使其在宿主菌E.coli BL(21)star中表达,并优化表达条件。另外采用亲和层析方法纯化融合蛋白GA2ox1, Western Blot鉴定是否为目的蛋白。论文的具体结果如下：(1)通过生物信息学分析GA2ox1基因编码蛋白。结果显示,GA2ox1基因的ORF编码蛋白质全长329个氨基酸,分子量为36.7314kD,等电点为8.5793,没有明显疏水性,含一个潜在的跨膜区,N端没有信号肽序列,二级结构丰富,含有磷酸化位点、N-糖基化位点、N-酰基化位点、ATP/GTP结合位点等蛋白修饰及活化位点,三级结构显示该蛋白空间构象不对称,折叠成松散的球状蛋白。(2)以哥伦比亚野生型拟南芥为实验材料,拟南芥总RNA为模板,采用RT-PCR扩增得到GA2ox1基因的ORF,大小约为990bp,与预期相符。(3)成功地构建了原核表达载体pDEST17-GA2ox1。将其转化宿主菌E.coli BL(21)star,得到原核表达工程菌,命名为BL(21)star-pDEST17-GA2oxl。(4)使用诱导剂IPTG诱导GA2ox1基因在宿主菌E.coli BL(21)star中成功表达融合蛋白GA2ox1, SDS-PAGE分析该蛋白是以包涵体形式存在,分子量约40kD与预期相符。并确定最优表达条件为：IPTG浓度0.2 mmol/L、温度30℃、诱导时间6 h。(5)探索表达蛋白GA2ox1的纯化条件。得到了大量、高纯度的GA2ox1融合蛋白,经Western Blot鉴定,纯化的蛋白为我们所需的目的蛋白。以上结果为下一步研制GA2ox1多克隆抗体、对GA2ox1基因进行蛋白水平的分析和研究GA2ox1蛋白的功能,及赤霉素调控植物生长的相关研究奠定了基础。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-10
插图索引  10-11
附表索引  11-12
缩略词  12-14
第1章 绪论  14-28
  1.1 赤霉素的研究  14-22
    1.1.1 赤霉素的发现  14
    1.1.2 赤霉素的构成及分类  14-15
    1.1.3 赤霉素的生物合成途径  15-17
    1.1.4 赤霉素合成途径中的关键酶及其基因  17-19
    1.1.5 赤霉素的信号转导  19-22
  1.2 大肠杆菌原核表达系统的研究  22-26
    1.2.1 大肠杆菌原核表达系统的组成  22-24
    1.2.2 大肠杆菌原核表达系统的影响因素  24-26
  1.3 研究目的与意义  26
  1.4 研究内容与技术路线  26-28
第2章 GA2ox1基因编码蛋白质的生物信息学分析  28-37
  2.1 生物信息学工具及方法  28-29
    2.1.1 拟南芥基因数据库TAIR  28
    2.1.2 蛋白质预测分析软件ExPASy  28
    2.1.3 蛋白质跨膜分析软件DAS-TMfilter server  28
    2.1.4 蛋白质可溶性分析软件Predict Protein及Biotech  28
    2.1.5 蛋白质二级结构分析软件Mobyle及SSCP  28
    2.1.6 蛋白结构信号肽预测软件SignalP 3.0 Server  28-29
    2.1.7 蛋白质三级结构分析软件CPH models 3.0  29
  2.2 结果与分析  29-35
    2.2.1 GA2ox1编码蛋白的氨基酸组成分析  29
    2.2.2 GA2ox1编码蛋白的疏水性分析  29-30
    2.2.3 GA2ox1编码蛋白的跨膜区分析  30-31
    2.2.4 GA2ox1编码蛋白的可溶性分析  31
    2.2.5 GA2ox1编码蛋白的二级结构分析  31-33
    2.2.6 GA2ox1编码蛋白的信号肽及模体分析  33-34
    2.2.7 GA2ox1编码蛋白的三级结构分析  34-35
  2.3 讨论  35-36
  2.4 本章小结  36-37
第3章 GA2ox1基因的克隆及原核表达工程菌的构建  37-48
  3.1 材料与方法  37-44
    3.1.1 实验材料  37-38
    3.1.2 实验方法  38-44
  3.2 结果与分析  44-46
    3.2.1 GA2ox1基因的PCR扩增  44
    3.2.2 BP反应构建入门克隆pDONR207-GA2ox1  44-45
    3.2.3 LR反应构建原核表达载体pDEST17-GA2ox1  45
    3.2.4 原核表达工程菌BL(21)star-pDEST17-GA2ox1的获得  45-46
  3.3 讨论  46-47
  3.4 本章小结  47-48
第4章 GA2ox1基因的原核表达及纯化  48-59
  4.1 材料与方法  48-53
    4.1.1 实验材料  48-50
    4.1.2 实验方法  50-53
  4.2 结果与分析  53-57
    4.2.1 GA2ox1原核表达的可溶性分析  53
    4.2.2 GA2ox1原核表达条件的优化  53-55
    4.2.3 GA2ox1蛋白的纯化  55-56
    4.2.4 Western Blot鉴定纯化蛋白  56-57
  4.3 讨论  57-58
  4.4 本章小结  58-59
结论  59-60
参考文献  60-65
附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录  65-66
致谢  66

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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