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超声微泡破坏增强基因转染效率的体外研究

作　者: 黄桂
导　师: 吕清
学　校: 华中科技大学
专　业: 影像医学与核医学
关键词: 超声靶向微泡破坏基因治疗辐照参数浓度声孔效应
分类号: R310
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

第一部分不同超声微泡浓度及质粒浓度对pEGFP-N1-VEGF重组质粒转染效率的研究目的探讨不同微泡浓度及质粒浓度对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)存活率及pEGFP-N1-VEGF重组质粒转染率的影响,初步探索最佳的质粒浓度及微泡浓度。方法将状态良好的HUVEC交叉植入24孔板中的,对照组仅进行超声辐照,实验组中加入不同质粒浓度和微泡浓度,然后进行超声辐照。加入质粒使其终浓度分别为5μl/ml、10μl/ml、15μl/ml、20μl/ml、25μl/ml、30μl/ml,加入微泡使其终浓度分别为0μl/ml、50μl/ml、100μl/ml、150μl/ml、200μl/ml、250μl/ml。48h后台盼蓝染色检测细胞存活率,荧光显微镜定性观察绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪定量检测基因转染率,并用western-blotting对导入外源性基因在离体细胞中表达VEGF进行检测。结果实验组中各亚组均有不同程度地荧光蛋白的表达。当质粒浓度小于等于20μl/ml时,基因转染率随质粒浓度的增加而增加,差异有统计学意义(P<0.05);但大于20μl/ml时,基因转染率随质粒浓度增加改变不明显,差异无统计意义(P>0.05)。细胞存活率与质粒浓度无明显关系。基因的转染率随体系微泡浓度呈现先增加后降低的趋势,当微泡浓度为150μl/ml时,基因转染率最高,差异有统计学意义(P<0.05);而细胞存活率随微泡浓度的增加而降低,差异有统计学意义(P<0.05)。western-blotting检测,对照组条带显示较弱,各实验亚组有不同程度条带显示,强于对照组。结论在一定的辐照参数时,不同质粒浓度和微泡浓度时基因转染率不同,质粒浓度为20μl/ml,微泡浓度为150μl/ml是比较理想的条件,此时的细胞存活率为(85.69±0.27)%,基因转染率为(15.86±0.43)%,为后续基因转染率最佳参数的研究提供了参考。第二部分不同超声辐照参数对pEGFP-N1-VEGF重组质粒转染效率的研究目的探讨不同超声辐照参数对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)存活率及pEGFP-N1-VEGF重组质粒转染率的影响,初步探索最佳的超声辐照参数。方法将状态良好的HUVEC交叉植入24孔板中的。设对照组与实验组,对照组中仅加入超声微泡150μl/ml与质粒20μl/ml(第一部分得出最佳质粒浓度与微泡浓度),不进行超声辐照;实验组按不同辐照参数均进行超声辐照。辐照参数分别设为发射频率(1MHZ、3MHZ)、功率(0.5 W/cm2、1.0 W/cm2、1.5 W/cm2、2.0 W/cm2)、占空比(10%、20%、50%)与辐照时间(60s、120s、180s)四个因素。超声辐照48h后台盼蓝染色检测细胞的存活率,荧光显微镜定性观察绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪定量检测基因转染率,用western-blotting对导入外源性基因在离体细胞中表达VEGF进行检测。结果转染后光镜下观察,可见不同程度的细胞形态改变,脱离孔板,甚至漂浮死亡。台盼蓝染色结果显示,实验组各亚组与对照组细胞存活率比较,差异有统计学意义(P<0.05);当任意三个参数一定时,细胞存活率随着余下参数的增加而降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。荧光显微镜下观察,对照组未见荧光蛋白表达;实验组各亚组均见不同程度地荧光蛋白表达。流式定量分析示,当三个参数一定时,基因转染率随另一参数增加,或升或降或先升后降,差异有统计学意义(P<0.05)。在发射频率1MHZ、功率1.5W/cm2、占空比20%、辐照时间120s时基因转染率最高,为(22.81±0.38)%。单因素方差分析显示,该组与其他实验亚组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。在此条件下,细胞存活率为(71.57±0.96)%。析因设计分析结果显示,四种参数的主因素分析差异均具有统计学意义(P<0.05),四种因素之间均具有交互效应(P<0.05)。结论对转染参数的优化可以减少对细胞的损失,获得较高的基因转染率,有望成为一种有效、安全的基因传输策略。

全文目录

英汉缩略语名词对照表  5-6
中文摘要  6-8
Abstract  8-11
前言  11-12
第一部分不同超声微泡浓度及质粒浓度对pEGFP-N1-VEGF 重组质粒转染效率的研究  12-28
  前言  12
  材料与方法  12-16
  结果  16-18
  讨论  18-22
  参考文献  22-25
  附图及表格  25-28
第二部分不同超声辐照参数对pEGFP-N1-VEGF 重组质粒转染效率的研究  28-41
  前言  28
  材料与方法  28-29
  结果  29-31
  讨论  31-34
  参考文献  34-37
  附图及表格  37-41
综述  41-52
  参考文献  47-52
攻读学位期间发表论文  52-53
致谢  53-54

超声微泡破坏增强基因转染效率的体外研究

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