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成骨生长肽对OPG基因剔除小鼠骨质疏松治疗作用的分子机制

作　者: 郭常军
导　师: 张键；费琴明；高建军
学　校: 复旦大学
专　业: 外科学
关键词: 成骨生长肽(0GP) 骨保护素(OPG) 小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs) 增殖分化 CDK2/CyclinA
分类号: R580
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：骨质疏松症是骨科常见疾病之一,随着我国进入老龄化,骨质疏松性骨折的发生率逐年上升,是老年人致残的主要因素。既往在研究骨质疏松症的动物模型中,骨保护素(osteoprotegerin,OPG)基因剔除小鼠模型符合高转换型骨质疏松症表现。成骨生长肽(osteogenic growth peptide,OGP)是一种在体外具有促进成骨细胞或间质细胞增殖、分化、成熟的作用,在体内也能促进全身骨量增加的多肽。本研究通过体外培养OPG基因敲除小鼠(OPG-/-)骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs),并与骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)对照,探讨OGP对体外培养的OPG-/-小鼠BMSCs的增殖和分化作用,分析OGP对其作用的分子机制,为OGP治疗骨质疏松症提供理论依据。方法：1. BMSCs分离培养：取12 w龄雄性OPG-/-小鼠,采用贴壁法培养BMSCs,给予10%FBS的LG-DMEM(Low Glucose-Dulbecco modified eagle medium)和矿化液(10-8mol/L地塞米松+10-2mol/Lβ-甘油磷酸钠+50 ug/ml L-抗坏血酸)的培养条件,进行BMSCs形态特征和生长特性观察。2.细胞增殖率观察和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)含量测定：取第一代骨髓间充质干细胞(passage first,P1)分为OGP组、对照组和BMP-2组,各组分别取1 d、3 d、5 d、7 d四个时间点。在各个时间段,分别在所需检测的培养孔内,按照二甲基噻唑二苯基四唑溴盐法(methyl thiazolyl tetrazolium method, MTT)和磷酸对硝基苯法(ρ-nitrophenylphosphate, PNPP)分别测定细胞增殖率和碱性磷酸酶含量,与BMP-2对比,比较OGP对OPG-/-小鼠的BMSCs增殖率和ALP含量的变化。3.定量Real-Time PCR:按以上条件培养P1 BMSCs 3 d后,分为三组,提取RNA,定量分析细胞周期指标Cyclin A和CDK2、分化指标Runx2和Osterix的基因水平表达,比较三组在mRNA水平的变化。4. Western-blot分析：按以上条件培养P1 BMSCs 7 d后,分为三组,观察BMSCs增殖和向成骨细胞分化的相关蛋白水平的表达,与BMP-2比较,分析OGP对其作用的可能机制。结果：1.OPG-/-小鼠的BMSCs形态特征和生长特性方面：在传第三代的情况下,细胞生长速度很慢,很难融合,故我们选择P1代细胞进行实验。但在BMSCs形态上,显微镜下观察未见明显差异。2.在含10%FBS的LG-DMEM和矿化液的培养的第3 d、5 d、7 d, OGP对OPG-/-BMSCs增殖作用均高于空白对照组和BMP-2组(P<O.05)；OGP对OPG-/-小鼠的BMSCs ALP含量变化的作用与空白对照组相似,而与BMP-2组存在较大差距,BMP-2在第3 d、5 d和7 d的ALP含量均高于空白对照组和OGP组(P<0.05)。3.定量Real-Time PCR分析表明：OGP组在细胞周期指标Cyclin A和CDK2 mRNA水平明显上调(P<0.01),但在分化指标Runx2和Osterix的基因水平与空白对照组相似,与BMP-2组相差较远。4.各组均能观察到相应的抗体表达,OGP组在Cyclin A和CDK2蛋白水平明显升高(P<0.01)；BMP-2组在Runx2和Osterix蛋白水平较对照组明显升高(P<0.01),而OGP组与空白对照组相似。结论：1.OGP对OPG-/-小鼠BMSCs在10%FBS的LG-DMEM和矿化液的培养条件下,具有明显促增殖作用,但是在ALP含量上明显弱于BMP-2；2.OGP对OPG-/-小鼠BMSCs增殖作用机制可能是通过激活CDK2/CyclinA途径,促进S期细胞增殖；3.OGP对OPG-/-小鼠BMSCs向成骨细胞方向的作用弱于BMP-2,可能与OPG基因敲除有关,具体机制有待进一步研究。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
前言  9-12
第一部分 OGP对OPG~(-/-) BMSCs的增殖和分化作用  12-21
  材料与方法  12-15
  结果  15-18
  讨论  18-20
  小结  20-21
第二部分 OGP对OPG~(-/-) BMSCs增殖分化相关基因和蛋白的表达作用  21-38
  材料与方法  21-29
  结果  29-34
  讨论  34-37
  小结  37-38
全文总结  38-39
参考文献  39-43
综述  43-50
致谢  50-51
附录  51-56
  论文及会议题录  51-52
  试剂配制  52-55
  缩略语索引  55-56

成骨生长肽对OPG基因剔除小鼠骨质疏松治疗作用的分子机制

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