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FAK表达水平对肝癌细胞SMMC-7721细胞学行为影响的实验研究

作　者: 张楠楠
导　师: 侯颖春
学　校: 陕西师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 黏着斑激酶 肝癌 RNA干扰 细胞运动 增值 凋亡
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


肝癌(Hepatocarcinoma)是人类常见的恶性肿瘤之一,在世界上大多数国家发病率呈逐年上升的趋势。肝癌预后并没有随着诊疗技术的提高而改善,转移和复发是肝癌病人术后生存的主要障碍。研究肝癌细胞迁移、增殖及凋亡与肝癌发生发展进程的关系,对寻找治疗肝癌的分子靶点,预防术后复发,提高疗效有重要意义。粘着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)是一个多功能的非受体酪氨酸激酶,在整合素介导的细胞粘附和生长因子受体引发的信号转导通路中起关键作用。研究证明,FAK的过表达与肝癌的侵袭及转移密切相关。然而FAK参与肝癌发生发展进程的分子机制并不清楚,通过下调FAK的表达水平来抑制肝癌侵袭转移的研究也不多,因此本课题以肝癌细胞系SMMC-7721为研究对象,研究RNA干扰(RNAinterference)沉默FAK表达对肝癌SMMC-7721细胞株生物学行为的影响。首先构建FAK-pU6H1重组质粒,将其用磷酸钙法瞬时转染到SMMC-7721细胞中,在此基础上,探讨FAK表达降低对肝癌细胞迁移、增殖及凋亡的影响作用,为肝癌的基因治疗提供新的靶点和实验材料。方法：(1)利用生物信息学技术在线设计特异性的FAK-siRNA,在体外构建重组质粒pU6H1-GFP-siFAK及pU6H1-GFP-siRNASCR;(2)用磷酸钙法将重组质粒分别转染入肝癌细胞SMMC-7721;(3)实验分组：正常对照组(NC组)：转染液、阴性对照组(NT组)：pU6H1-GFP-siRNASCR+转染液、干扰组1(F1组)：pU6H1-GFP-siFAK1+转染液、干扰组2(F2组)：pU6H1-GFP-siFAK2+转染液、干扰组3(F3组)：pU6H1-GFP-siFAK3+转染液、干扰组4(F4组)：pU6H1-GFP-siFAK4+转染液；(4)用半定量RT-PCR、Western Blot和免疫细胞化学方法检测转染后各组细胞FAK mRNA和蛋白表达水平,鉴定重组载体的功能；(5)损伤修复法、MTT法和Hoechst染色法检测FAK表达降低对SMMC-7721细胞迁移、增值能力以及凋亡的影响。结果：(1)细胞转染效率的观察：转染后60h转染效率最高。(2)RT-PCR及WesternBlot结果：干扰组FAK-siRNA能使SMMC-7721细胞中FAK mRNA及蛋白表达下调。转染48h后,F1-F4组FAK mRNA的抑制率分别是25.4%、62.4%、32.7%和46.2%,与正常组比较差异具有统计学意义(p<0.01)；转染72h后,F1-F4组中FAK蛋白表达的抑制率分别为31.9%、36.7%、49.2%和45.8%,与正常组比较差异具有统计学意义(p<0.01)。(3)免疫细胞化学检测结果显示,NC组及NT组的SMMC-7721细胞FAK强阳性表达,而F3组细胞中FAK蛋白的表达明显减弱。(4)损伤修复实验、MTT法及Hoechst染色实验结果：SMMC-7721细胞转染72h后F1-F4组的迁移率分别是：44.35±1.91、39.99±2.15、35.16±2.43和36.57±1.17,与正常组细胞迁移率：52.29±1.81比较,差异有统计学意义(p<0.01)；MTT结果显示FAK-siRNA作用于SMMC-7721细胞48h后,F1-F4组细胞增殖抑制率分别为12.8%、19.4%、25.7%和24.9%(p<0.05),表明细胞生长明显受到抑制；Hoechst染色实验结果显示,转染后FAK-siRNA组凋亡细胞的数目显著多于正常组；上述实验中NT组和NC组之间均无统计学意义(p>0.05)。结论：构建的重组表达质粒pU6H1-GFP-siFAK能有效地抑制转染后SMMC-7721细胞株的FAK mRNA及蛋白的表达；FAK表达降低能明显抑制SMMC-7721细胞的迁移及增殖能力、促进肝癌细胞的凋亡。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-11
第一章 引言  11-22
  1 黏着斑激酶—肿瘤治疗的新靶点  11-15
    1.1 FAK的结构  11-12
    1.2 FAK的活性调控  12-13
    1.3 FAK介导肿瘤细胞的迁移、增殖以及凋亡  13-15
  2 RNA干扰及应用  15-22
    2.1 RNA干扰  15-18
    2.2 RNAi技术应用于FAK的相关研究  18-20
    2.3 FAK与肝癌  20-22
第二章 研究论文的立论依据、内容及目的意义  22-24
第三章 RNAi对SMMC-7721细胞FAK表达的抑制  24-46
  1 材料  24-29
    1.1 细胞及质粒  24
    1.2 主要试剂及仪器  24-26
    1.3 试剂配制  26-29
  2 实验方法  29-37
    2.1 siRNA序列的设计及质粒构建  29-30
    2.2 质粒制备  30-31
    2.3 实验分组  31
    2.4 细胞培养  31
    2.5 细胞转染及观察转染效率  31-32
    2.6 RT-PCR检测FAK基因表达  32-33
    2.7 Western Blot检测FAK蛋白表达情况  33-36
    2.8 免疫细胞化学检测  36-37
    2.9 统计学处理  37
  3 实验结果  37-42
    3.1 重组质粒电泳检测及浓度测定  37-38
    3.2 细胞转染效率的观察  38
    3.3 RT-PCT检测FAK mRNA水平  38-41
    3.4 FAK蛋白表达变化  41-42
    3.5 FAK蛋白定位表达变化  42
  4 讨论  42-46
    4.1 FAK siRNA的设计  42-43
    4.2 重组质粒的构建和导入细胞  43-44
    4.3 FAK基因表达的抑制  44-46
第四章 FAK表达减弱对SMMC-7721细胞迁移、增值以及凋亡的影响  46-54
  1 材料  46
    1.1 细胞及质粒  46
    1.2 主要试剂及仪器  46
    1.3 主要试剂配制  46
  2 实验方法  46-48
    2.1 损伤修复法  46-47
    2.2 MTT法  47
    2.3 Hoechst 33258染色  47
    2.4 统计学处理  47-48
  3 实验结果  48-50
    3.1 细胞迁移能力变化  48-49
    3.2 细胞增殖情况  49-50
    3.3 细胞凋亡的形态学观察  50
  4 讨论  50-54
    4.1 FAK与肿瘤细胞的运动  51
    4.2 FAK与肿瘤细胞的增殖  51-52
    4.3 FAK与肿瘤细胞的凋亡  52-53
    4.4 靶点的抑制效应比较  53
    4.5 RNAi应用存在的问题  53-54
总结  54-55
参考文献  55-61
致谢  61-62
攻读硕士学位期间的研究成果  62-63

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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