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生防细菌的农药降解特性及其降解机制的研究

作　者: 安霞
导　师: 赵蕾
学　校: 山东师范大学
专　业: 食品科学
关键词: 多粘类芽孢杆菌 苍白杆菌 拮抗 拟除虫菊酯降解酶 纯化
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


长期以来,植物病虫害防治中大量化学农药的使用造成的病原菌和害虫的抗药性以及土壤和作物中的农药残留,给人类健康和生态环境造成了严重的危害。近年来,生物防治以其无毒无害,不污染环境,不易引起抗药性等特点备受社会各界的广泛关注,许多生防菌剂已得到成功地应用,与此同时,利用微生物进行土壤修复的研究也取得了很大的进展。据报道,有些生防细菌也具有农药降解作用,若能分离到兼具生防和农药降解作用的微生物,将对农业的可持续发展具有重要意义。而目前国内外在此领域的研究却少有开展。为此,我们以多种土传植物病原真菌为靶标,以3种常用的杀虫剂为筛选底物,从花生根际土壤中筛选到对多种植物病原真菌具有拮抗作用且对多种农药具有降解作用的细菌,并对其降解特性和降解机制进行了初步研究,具体结果如下:1.从山东泰安的花生根际土壤中分离到54株细菌,从中筛选到对棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum）等多种植物病原真菌具有明显拮抗作用的生防细菌B3、H10,通过形态特征、生理生化及16S rDNA同源性序列分析,将其分别鉴定为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）、苍白杆菌（Ochrobactrum spp.）。2.抑菌实验发现,H10发酵液及其80%硫酸铵饱和度的粗蛋白质沉淀对西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）和黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）的生长均具有明显的抑制作用。镜检发现,病原菌菌丝严重扭曲、变形膨大成珠状、原生质浓缩,并在粗蛋白质沉淀中检测到了蛋白酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活力,表明H10产生的胞外水解酶破坏了病原真菌的细胞壁。3.为了研究生防菌的农药降解特性,本研究采用紫外分光光度法分别测定生防细菌B3、H10对3种常用杀虫剂（合成拟除虫菊酯类的高效氯氰菊酯、有机磷类的毒死蜱、烟碱类的吡虫啉）的降解率。在原药含量为100 mg/L时,菌株B3对3种农药7 d的降解率分别为54.42%、57.44%和49.24%,菌株H10对3种农药60 h的降解率分别为83.51%、79.82%、59.12%,当高效氯氰菊酯浓度在400mg/L时降解率达到最大,为75.55%,但底物浓度高至700mg/L,大多数微生物不能忍受,而该菌仍可生长,降解率达60.05%;接种量为5%时降解率最高,达89.61%;在农药培养基中添加少量碳源或氮源,均有利于菌株H10对高效氯氰菊酯的降解。4.为了深入研究生防菌的农药降解机制,本实验对H10拟除虫菊酯降解酶进行了分离纯化。采用超声波细胞破碎、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析,纯化出一种拟除虫菊酯降解酶。经SDS-PAGE电泳染色后呈单带,分子量约为65.0 kD。降解实验发现,150μL该酶液在30 min内可将10 mL 50 mg/L的高效氯氰菊酯完全降解。5.为进一步研究该酶的性质,本实验以对硝基苯乙酸酯为底物测定了温度、pH、金属离子对酶活性的影响。结果表明:酶作用的最适温度为40℃,在40℃以下稳定性良好;最适pH为8.0,在pH 6.0～9.0之间具有较高的稳定性,酶活力维持在70%以上;Na+、EDTA对酶活无影响,Ca2+、Mg2+能够降低酶的活性,而过渡态金属离子Zn2+、Fe3+、Cu2+有强烈的抑制作用。

全文目录


中文摘要  8-10
Abstract  10-12
第一章 文献综述  12-28
  1 拮抗细菌在植物病害生物防治中的应用概况  12-17
    1.1 目前拮抗细菌应用的主要种类  13-14
      1.1.1 芽孢杆菌（Bacillus spp.）  13
      1.1.2 假单胞杆菌（Pseudomonas spp.）  13-14
      1.1.3 土壤放射杆菌（Agrobacterium radiobacter）  14
      1.1.4 类芽孢杆菌（Paenibacillus spp.）  14
    1.2 拮抗细菌的抑菌机制和抑菌结果  14-16
      1.2.1 拮抗作用  14-15
      1.2.2 竞争作用  15
      1.2.3 寄生作用  15
      1.2.4 诱导系统抗性（ISR）  15-16
    1.3 拮抗细菌生防作用的发展趋势和研究展望  16-17
  2 微生物应用于生物修复的研究进展  17-25
    2.1 常用3 种农药的危害和研究现状  18-21
      2.1.1 拟除虫菊酯类农药的危害及研究现状  18-19
      2.1.2 有机磷农药的危害及研究现状  19-20
      2.1.3 烟碱类农药的危害及研究现状  20-21
    2.2 农药残留微生物降解的研究现状  21-22
      2.2.1 可降解农药的微生物菌株的筛选  21
      2.2.2 农药降解菌的获得途径与鉴定  21-22
    2.3 农药微生物降解能力的测定  22-24
      2.3.1 分光光度法  23
      2.3.2 气相色谱法（GC）  23
      2.3.3 高效液相色谱法（HPLC）  23-24
      2.3.4 气相色谱法一质谱联用技术（GC-MC）  24
    2.4 农药微生物中降解酶的研究  24-25
  3 本研究的立题依据、研究内容及技术路线  25-28
    3.1 立题依据  25-27
    3.2 研究内容  27
    3.3 技术路线  27-28
第二章 生防细菌的分离、筛选及鉴定  28-42
  1 材料与方法  28-32
    1.1 实验材料  28-30
      1.1.1 土样  28
      1.1.2 病原真菌  28
      1.1.3 培养基  28-29
      1.1.4 主要仪器和试剂  29-30
    1.2 实验方法  30-32
      1.2.1 土壤细菌的分离  30
      1.2.2 拮抗性检测  30-31
      1.2.3 菌种形态和生理生化鉴定  31
      1.2.4 菌种分子生物学鉴定  31-32
  2 结果与分析  32-40
    2.1 拮抗细菌的分离筛选  32-34
    2.2 菌株菌落形态和生理生化鉴定  34-36
      2.2.1 菌落形态  34
      2.2.2 个体形态  34-35
      2.2.3 生理生化特征  35-36
    2.3 菌株的分子鉴定  36-40
      2.3.1 菌株总DNA 的提取  36
      2.3.2 菌株16S rDNA 序列的克隆  36-40
  3 讨论  40-42
    3.1 广谱生防细菌的筛选  40
    3.2 细菌鉴定  40-41
    3.3 生防细菌研究现状  41-42
第三章 生防细菌的拮抗机制及其盆栽促生效果  42-53
  1 材料与方法  42-47
    1.1 实验材料  42-43
      1.1.1 菌株  42
      1.1.2 培养基  42-43
      1.1.3 主要仪器和试剂  43
    1.2 实验方法  43-47
      1.2.1 发酵液对病原真菌的抑制实验  43-44
      1.2.2 发酵液对病原菌菌丝的影响  44
      1.2.3 发酵液粗蛋白对病原真菌的抑制实验  44
      1.2.4 胞外酶活力测定  44-46
      1.2.5 菌株H10 对黄瓜的盆栽促生效果  46-47
  2 结果与讨论  47-52
    2.1 发酵液对病原真菌的抑制实验  47-49
      2.1.1 发酵液对病原真菌的抑制试验结果  47
      2.1.2 发酵液对病原真菌菌丝的作用  47-48
      2.1.3 粗蛋白质沉淀对病原菌的抑制实验结果  48-49
    2.2 酶活力测定实验结果  49-50
      2.2.1 胞外蛋白酶活力  49
      2.2.2 几丁质酶活力  49-50
      2.2.3 β-1,3-葡聚糖酶活力  50
    2.3 H10 的盆栽促生效果  50-52
  3 讨论  52-53
第四章 生防细菌对农药降解特性的研究  53-65
  1 材料与方法  53-57
    1.1 实验材料  53-55
      1.1.1 菌株  53
      1.1.2 培养基  53-54
      1.1.3 主要仪器和试剂  54-55
    1.2 实验方法  55-57
      1.2.1 农药降解菌的筛选  55
      1.2.2 降解菌对农药的降解率  55-56
      1.2.3 降解菌对高效氯氰菊酯的降解特性  56-57
  2 结果与分析  57-63
    2.1 特征吸收峰的检出  57-58
    2.2 标准曲线的制作  58
    2.3 分光光度法测定回收率结果  58-59
    2.4 菌株对3 种杀虫剂的降解作用  59-60
    2.5 H10 菌株对高效氯氰菊酯的降解特性  60-63
      2.5.1 H10 菌株对农药的耐受能力  60-61
      2.5.2 H10 接种量与降解率的关系  61-62
      2.5.3 初始pH 值对H10 降解率的关系  62
      2.5.4 外加碳源对H10 降解率的影响  62-63
      2.5.5 氮源对H10 降解率的影响  63
  3 讨论  63-65
    3.1 农药的微生物降解研究现状  63-64
    3.2 H10 对高效氯氰菊酯的降解特性  64-65
第五章 拟除虫菊酯降解酶的分离纯化及其特性研究  65-79
  1 材料与方法  65-72
    1.1 实验材料  65-66
      1.1.1 菌株  65
      1.1.2 培养基  65
      1.1.3 主要仪器和试剂  65-66
    1.2 实验方法  66-72
      1.2.1 液体发酵培养  66-67
      1.2.2 高效氯氰菊酯降解酶活力测定  67
      1.2.3 蛋白质含量测定  67-68
      1.2.4 菌株H10 高效氯氰菊酯降解酶的分离纯化  68
      1.2.5 拟除虫菊酯降解酶的纯度鉴定及相对分子量的测定  68-70
      1.2.6 酶对高效氯氰菊酯农药的降解  70
      1.2.7 酶学性质研究  70-72
  2 结果与分析  72-77
    2.1 蛋白质含量标准曲线  72
    2.2 酶的分离纯化  72-74
      2.2.1 DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析  72-73
      2.2.2 Sephadex G-75 分子筛层析  73
      2.2.3 菌株H10 拟除虫菊酯酶的纯化结果  73-74
    2.3 酶对高效氯氰菊酯的降解  74-75
    2.4 酶学性质研究  75-77
      2.4.1 酶反应最适温度  75-76
      2.4.2 酶反应最适pH  76-77
      2.4.3 不同金属离子对酶活力的影响  77
  3 讨论  77-79
第六章 结论  79-80
参考文献  80-88
附录：实验所用标准曲线  88-91
致谢  91-92
攻读学位期间发表论文情况  92

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治
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