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RNA干扰抑制的肉桂酰辅酶A还原酶和咖啡酸转移酶还原酶对单参木质素沉积及水溶性次生代谢物影响

作　者: 刘晓晶
导　师: 杨章民
学　校: 陕西师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 丹参肉桂酰辅酶A还原酶咖啡酸-3-O-甲基转移酶还原酶 RNAi 木质素
分类号: S567.53
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 77次
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内容摘要

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是一种在我国广泛分布的常见药用植物,作为一种传统中药材,其药用部位主要为根。被广泛应用于心脑血管、月经不调以及各种炎症等疾病的治疗。根据药理学研究,丹参的有效成分主要分为两大类：一类为脂溶性的丹参酮类化合物,包括丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酸甲酯、二氢丹参酮等；另一类为水溶性的酚酸类物质,包括丹参素、紫草酸、丹酚酸以及迷迭香酸等。根据现代药理学表明水溶性成分具有显著药理活性,同时传统用药大都采用水煎法,近年来的热点已逐渐从对丹参脂溶性化合物的研究转移到对丹参水溶性酚酸类物质的研究上。已有实验表明,丹参中水溶性物质的合成与苯丙烷代谢途径相关。本研究选取苯丙烷类代谢途径中的两个关键酶,肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductas, CCR)和咖啡酸-3-O-甲基转移酶还原酶(Caffeic acid O-methyltransferase, COMT),对其采用RNAi的手段研究其功能,初步探讨CCR基因和COMT基因与丹参次生代谢物与木质素合成之间的关系,为阐明丹参水溶性成分合成途径提供依据,同时,为进一步利用基因工程改良丹参品种、提高丹参有效成分的含量等奠定基础。主要的研究方法和结果如下：1.选取CCR基因和COMT基因上一段长为296bp和340bp的片段作为靶片段,构建了丹参CCR基因和COMT基因的RNAi载体pKANNIBAL/CCR, pKANNIBAL/COMT。利用农杆菌介导的叶盘转化法,将载体pKANNIBAL/CCR, pKANNIBAL/COMT转入丹参中,经50mg/L卡那霉素筛选以及PCR检测获得了18株和21株阳性转基因株系。2.对阳性转基因植株的表型进行了观察,用间苯三酚对转基因植株的茎切片进行染色,与对照植株相比,转基因植株中总木质素的含量表现为不同程度的下降。用KMnO4对干涉体植株的茎切片进行染色,观察S-型木质素含量的变化情况,结果表明,大多数转基因植株的S-型木质素含量略有下降。3.用GC-MS分析CCR和COMT干涉体中,木质素单体含量的变化。结果表明,不同的阳性株系中,木质素单体的含量均有不同程度的下调。4.用Gravimetric methods, Klason lignin方法对阳性植株中的总木质素含量进行检测,同时分别检测克拉森木质素含量和酸可溶性木质素的含量。结果显示,CCR中克拉森木质素含量降低,酸可溶性木质素含量上升；COMT中,卡拉森木质素含量有所下降,而酸可溶性木质素中,大部分上升,小部分下降,表现为不一致性,可能与基因表达量相关。5.对转基因株系中的水溶性酚酸类物质进行了HPLC分析,将CCR, COMT的根和叶分别与对照植株相比较,其结果出现不一致性。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
第1章引言  9-23
  1.1 丹参简介  9-12
    1.1.1 植物学特性  9
    1.1.2 丹参的药用价值  9-10
    1.1.3 丹参的有效成分  10-11
    1.1.4 丹参水溶性成分的生物合成途径  11
    1.1.5 丹参制剂  11-12
    1.1.6 丹参的药用成分分布  12
    1.1.7 丹参的栽培  12
  1.2 次生代谢的研究现状  12-16
    1.2.1 次生代谢物的分类  13-14
    1.2.2 植物次生代谢的主要合成途径  14-16
  1.3 木质素的合成  16-20
    1.3.1 木质素的分布  16
    1.3.2 木质素的代谢途径  16-17
    1.3.3 木质素的种类  17-19
    1.3.4 木质素合成中的关键酶  19-20
  1.4 本实验的研究目的与意义  20-23
第2章丹参CCR-RNAi和COMT-RNAi载体的构建  23-28
  2.1 材料  23-25
    2.1.1 植物材料  23
    2.1.2 菌株与质粒  23
    2.1.3 试剂与药品  23-24
    2.1.4 仪器  24-25
  2.2 方法  25-27
    2.2.1 酶切验证  25-26
    2.2.2 转染  26-27
  2.3 结果  27-28
第3章 CCR和COMT基因的分子水平检测  28-38
  3.1 实验材料  28-29
    3.1.1 植物材料  28
    3.1.2 试剂与药品  28
    3.1.3 仪器  28-29
  3.2 丹参CCR和COMT基因的DNA水平检测  29-31
    3.2.1 丹参总DNA的提取  29-30
    3.2.2 PCR扩增检测  30-31
  3.3 丹参CCR和COMT基因的RNA水平的分子检测  31-34
    3.3.1 RNA的提取  31
    3.3.2 cDNA第一链的获得  31-32
    3.3.3 cDNA质量的检测  32-33
    3.3.4 利用实时定量PCR分析CCR基因在不同株系丹参中的表达  33
    3.3.5 利用半定量PCR分析COMT基因在不同植株中的表达  33-34
  3.4 结果及分析  34-38
    3.4.1 DNA水平检测  34-36
    3.4.2 RNA水平分子检测结果  36-38
第4章木质素的检测  38-55
  4.1 木质素的组织化学检测  38-39
    4.1.1 实验材料  38-39
    4.1.2 方法  39
  4.2 总木质素的检测  39
  4.3 木质素单体含量的测定  39-41
    4.3.1 提取样品  39-40
    4.3.2 检测样品  40-41
  4.4 实验结果  41-51
    4.4.1 组织化学染色  41-49
    4.4.2 总木质素的测定结果  49-50
    4.4.3 木质素单体的测定  50-51
  4.5 讨论  51-55
    4.5.1 RNAi植株木质素的组织学变化  52
    4.5.2 RNAi植株木质素的含量检测  52-53
    4.5.3 RNAi植株木质素单体的含量检测  53-55
第5章干涉体植株中水溶性酚酸类物质积累的HPLC检测  55-65
  5.1 实验材料与方法  55-58
    5.1.1 材料  55
    5.1.2 实验仪器  55
    5.1.3 试剂及药品  55-56
    5.1.4 对照品溶液的制备  56
    5.1.5 测试样品溶液的制备  56
    5.1.6 线性关系考察  56
    5.1.7 精密度分析  56-57
    5.1.8 重复性实验  57
    5.1.9 加样回收率实验  57
    5.1.10 色谱条件  57-58
  5.2 结果与分析  58-61
    5.2.1 CCR干涉体  58-59
    5.2.2 COMT干涉体  59-61
  5.3 讨论  61-65
参考文献  65-70
致谢  70-71
攻读硕士学位期间研究成果  71

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