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南方红豆杉中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇高效诱导提取纯化工艺研究

作　者: 王莹
导　师: 付玉杰
学　校: 东北林业大学
专　业: 生药学
关键词: 南方红豆杉枝叶 高效诱导 三尖杉宁碱 7-表-10-去乙酰基紫杉醇 提取 纯化
分类号: S791.49
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本文以可再生南方红豆杉枝叶为原料,提取、分离、纯化紫杉烷类化合物—三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇。通过对南方红豆杉枝叶中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇含量的动态变化,以及紫外辐射、氧气空化、酸和酶诱导对南方红豆杉枝叶中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇含量变化的影响,确定了最佳采收期和酶诱导提取工艺,并首次通过大孔吸附树脂柱层析,正反相柱层析相结合的方法对三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的纯化工艺条件进行了系统的研究,得出如下结论：一、建立了三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的检测方法并掌握了二者含量时空变化趋势：1.三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的HPLC分析方法：色谱柱：Curosil-PFP色谱柱5μ(250 mm×4.6 mm I.D.),流动相：乙腈/水(42/58,v/v),流速：1 mL/min,进样量10μL,柱温：35℃,检测波长：234 nm。2.南方红豆杉枝叶中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇含量的动态变化规律和最佳采收期：三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇在一年中的含量变化趋势较为一致,均呈现先升高后降低再升高的趋势。其中11月份时二者含量达到峰值,在叶中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇含量分别为0.0342 mg/g和0.0271mg/g,在茎中二者含量分别为0.00272 mg/g和0.012 mg/g,因此确定11月为南方红豆杉的最佳采收期。通过对比新老茎叶中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇含量的变化,发现新茎叶中二者含量约为老茎叶中的50%,说明三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇都随着茎叶的成熟而逐渐累积。二、确立并优化了环境诱导提高三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇含量的方法：最佳诱导方法：酶诱导；酶种类：纤维素酶；酶浓度：1 mg/mL；酶诱导时间：24h；温度：45℃。三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的含量分别达到了0.027 mg/g和0.024 mg/g,较之前未经酶诱导样品提高了55.21%和52.13%。三、确定并优化了酶诱导后三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的提取工艺：提取方法：负压空化；提取溶剂：80%乙醇溶液；总液固比：30：1；提取时间：每次45min提取次数：3次。三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的含量分别为0.024 mg/g和0.021 mg/g。经酶转化后的三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇收率分别为89.61%和83.24%。四、富集纯化得到高纯度的三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇：1.首次应用大孔吸附树脂柱层析法富集南方红豆杉粗提物中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇。参数如下：大孔吸附树脂类型：AB-8；上样量与树脂量比：1：15(湿重)；洗脱剂组分及比例：50%乙醇溶液30BV、60%乙醇溶液10BV、65%乙醇溶液15BV。最终三尖杉宁碱纯度为0.875%,收率为76.54%,7-表-10-去乙酰基紫杉醇纯度为2.581%,收率为86.78%。2.采用正反相硅胶柱层析结合纯化三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇。正相硅胶柱层析条件：硅胶规格：300-400目；上样量与硅胶量比例：1：40；洗脱剂组分及比例：三氯甲烷-甲醇,90/1(v/v)；洗脱流速：30 d/min。反相硅胶柱层析条件：硅胶规格：ODS(C18)；上样量与硅胶量比例：1：195；洗脱剂组分及比例：乙腈-水,35/65(v/v)；洗脱流速为：20 d/min。经过正、反相硅胶柱层析后,最后获得了纯度分别为90.38%和93.47%的三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇,收率分别为77.25%和63.22%。经过酶诱导—负压空化提取—大孔树脂柱层析—正相柱层析—反相柱层析等一系列工艺后,最终三尖杉宁碱纯度为90.38%,总收率为82.23%,得率为0.014 mg/g；7-表-10-去乙酰基紫杉醇纯度为93.47%,总收率为69.55%,得率为0.011 mg/g。此工艺路线较传统工艺具有成本低,污染小,可行性强等特点,为开拓紫杉醇来源提供了有力的技术支持,具有重要的理论意义和应用价值。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-12
1 绪论  12-23
  1.1 红豆杉简介  12-13
  1.2 红豆杉的开发利用价值  13-14
  1.3 红豆杉的化学成份研究  14-18
    1.3.1 紫杉烷类化合物  14-18
    1.3.2 非紫杉烷类化合物  18
  1.4 紫杉烷类化合物的来源  18-19
    1.4.1 植物提取  18
    1.4.2 化学合成  18-19
    1.4.3 细胞培养  19
    1.4.4 微生物发酵  19
    1.4.5 基因工程  19
  1.5 诱导技术研究  19-20
    1.5.1 紫外诱导  19
    1.5.2 空化诱导  19-20
    1.5.3 酸诱导  20
    1.5.4 酶诱导  20
  1.6 大孔吸附树脂分离技术  20-21
    1.6.1 大孔吸附树脂的结构、组成和类型  20-21
    1.6.2 大孔吸附树脂技术的原理  21
    1.6.3 影响大孔吸附树脂的因素  21
    1.6.4 大孔吸附树脂在中药分离纯化中的应用  21
  1.7 柱层析技术  21-22
  1.8 研究目的和意义  22-23
2 三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇分析方法的建立  23-29
  2.1 实验材料和仪器  23-24
  2.2 实验方法  24
    2.2.1 标准溶液的配制  24
    2.2.2 样品溶液的制备  24
  2.3 结果与讨论  24-27
    2.3.1 色谱条件的优化  24-25
    2.3.2 方法学的确定  25-27
    2.3.3 样品溶液的测定  27
  2.4 本章小结  27-29
3 南方红豆杉中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的动态变化规律  29-34
  3.1 实验材料和仪器  29
  3.2 实验方法  29-30
  3.3 结果与讨论  30-32
    3.3.1 南方红豆杉叶和茎中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的时间分布规律  30-32
    3.3.2 南方红豆杉新叶萌发期新老叶与茎中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的分布规律  32
  3.4 本章小结  32-34
4 南方红豆杉中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的高效诱导  34-55
  4.1 实验材料和仪器  34-35
  4.2 紫外辐射对南方红豆杉中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的诱导  35-39
    4.2.1 实验方法  35
    4.2.2 结果与讨论  35-39
    4.2.3 本节小结  39
  4.3 氧气空化对南方红豆杉中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的诱导  39-41
    4.3.1 实验方法  40
    4.3.2 结果与讨论  40-41
    4.3.3 本节小结  41
  4.4 酸对红豆杉中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的诱导  41-46
    4.4.1 实验方法  41-43
    4.4.2 结果与讨论  43-46
    4.4.3 本节小结  46
  4.5 酶对南方红豆杉中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的诱导  46-53
    4.5.1 实验方法  47-48
    4.5.2 结果与讨论  48-53
    4.5.3 本节小结  53
  4.6 本章小结  53-55
5 南方红豆杉中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的提取  55-63
  5.1 实验材料和仪器  55
  5.2 实验方法  55-57
    5.2.1 不同提取方法的选择  55-56
    5.2.2 负压空化提取工艺优化  56-57
    5.2.3 工艺验证  57
  5.3 结果与讨论  57-62
    5.3.1 不同提取方法对三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇含量的影响  57-58
    5.3.2 不同提取溶剂对三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇含量的影响  58-59
    5.3.3 不同固液比对三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇含量的影响  59-60
    5.3.4 不同提取时间对三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇含量的影响  60-61
    5.3.5 不同提取次数对三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇含量的影响  61
    5.3.6 工艺验证  61-62
  5.4 本章小结  62-63
6 大孔树脂对三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的富集  63-72
  6.1 实验材料和仪器  63-64
  6.2 实验方法  64-66
    6.2.1 大孔吸附树脂的预处理  64
    6.2.2 树脂含水率的测定  64
    6.2.3 样品的制备  64-65
    6.2.4 大孔吸附树脂树脂对三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇吸附解吸效果比较  65
    6.2.5 大孔吸附树脂对三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇洗脱效果比较  65
    6.2.6 树脂的吸附量和解吸率公式  65
    6.2.7 AB-8大孔吸附树脂柱层析  65-66
  6.3 结果与讨论  66-71
    6.3.1 大孔吸附树脂树脂对三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇吸附解吸效果比较  66-67
    6.3.2 大孔吸附树脂对三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇洗脱效果比较  67-69
    6.3.3 AB-8大孔吸附树脂柱层析  69-71
  6.4 本章小结  71-72
7 南方红豆杉中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的纯化  72-78
  7.1 实验材料和仪器  72
  7.2 实验方法  72-74
    7.2.1 正相硅胶柱层析预处理与样品制备  72-73
    7.2.2 正相柱层析样品的洗脱  73
    7.2.3 薄层层析定性检测  73
    7.2.4 反相硅胶柱层析的预处理与样品制备  73
    7.2.5 反相柱层析样品的洗脱  73-74
  7.3 结果与讨论  74-76
    7.3.1 正相硅胶柱层析对三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的分离纯化  74-75
    7.3.2 反相硅胶柱层析对三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的分离纯化  75-76
  7.4 本章小结  76-78
结论  78-81
参考文献  81-85
攻读学位期间发表的学术论文  85-86
致谢  86-87

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林树种 > 针叶树类 > 红豆杉、紫杉
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