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弱精症精子mRNA和miRNA差异表达谱的构建与分析

作　者: 刘利敏
导　师: 黄天华
学　校: 汕头大学
专　业: 遗传学
关键词: 弱精症精子基因芯片表达谱
分类号: R698
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

【背景与目的】不孕不育是全球性医学问题,据世界卫生组织统计,全球约有5-10%的育龄夫妻存在不孕不育问题,其中男性原因所致不育占一半左右。精子活力低下导致的弱精症是男性不育的重要原因之一,20%的男性不育与精子活力低下直接相关,但其致病的分子机制仍不很清楚。目前相关研究大多从单个基因的角度探讨精子活力低下对弱精症的影响,但单个基因的改变并不能完全解释弱精症的致病机制。近年研究发现,精子虽然是高度特化的细胞,但精子中含有一定量的RNA,精子RNA在精子的运动、获能、受精和胚胎发育等过程中起着非常重要的作用。因此精子RNA可以作为一个衡量精子质量、预测精子受精能力的重要指标。本研究应用基因芯片技术和生物信息学的方法,建立健康能育男性和弱精症患者精子中mRNA和miRNA的表达谱,比较其表达差异,从多个mRNA和miRNA的角度上初步分析精子活力低下的分子机理,为以后弱精症的实验性研究提供一定依据。【对象和方法】1.标本收集:30例健康能育男性精液标本来自本实验室工作人员,30例弱精症患者精液标本来自汕头市生殖保健中心;2.高活力精子和低活力精子分离:应用SWIM-UP上游技术和Percoll细胞分离液来分离精子;3. mRNA和miRNA基因表达谱的构建:按照Ambion Amino公司的MessageAMPⅡaRNA labeling kit试剂盒标记aRNA,然后使用康成生命科学实验中心优化的缓冲液和实验方法将标记的aRNA与含有30 968个探针的Phalanx OneArrayTM芯片杂交;按照Exiqon公司的miRCURYTM Array Power Labeling kit标记miRNA,然后将标记的miRNA与含有2056个探针的Exiqon miRCURY? LNA microRNA芯片杂交。4.弱精症差异miRNA表达谱用Real-time RT-PCR进行验证。5.应用panther、DVID、miRBase、TarBase数据库分析弱精症mRNA和miRNA差异表达谱,包括聚类分析、分类分析、生物功能、染色体定位、细胞位置定位、基因组定位分析、miRNA在mRNA差异表达谱中对应的靶基因分析等。【结果】1高活力和低活力精子分离成功,无体细胞污染。2弱精症精子mRNA和miRNA差异表达谱制备成功。3 Real-time RT-PCR实验结果显示,10个差异表达的miRNA中有3个与差异miRNA表达谱调节方向一致。4 mRNA差异表达谱数据分析结果显示,上调基因有394个,表达差异最大的基因是OSGEP,其差异表达倍数是54.607。下调基因有437个,表达差异最大的是TRIM36,它的差异表达倍数是0.0861倍。(1)差异表达的基因主要参与蛋白代谢及修饰、核酸代谢、信号转导、发育过程、免疫及防御、细胞运输、细胞周期、细胞结构与运动等生物学过程以及由趋化因子和细胞因子介导的炎症反应、氧化应激反应、Wnt信号通路、Toll信号通路等生物学通路。(2)这些差异表达的基因主要分布在1、2、19号染色体上。(3)差异表达的基因中有160个基因位于细胞核,有283个基因位于细胞质,有41个分布于细胞膜或细胞外。(4)功能聚类结果显示,弱精症差异表达的上调基因功能主要集中在脂类代谢、物理化学刺激、压力应激、炎症反应、负向调控蛋白激酶和一些蛋白酶抑制活性等聚类,表达下调的基因主要集中在与精子发生、线粒体结构和呼吸链组分、蛋白代谢等基因聚类中。5差异miRNA表达谱分析结果显示,上调miRNA有93个,其中上调差异表达最大的是hsa-miR-516a-3p,它的差异表达倍数是10.72102。下调miRNA有103个,其中下调差异表达最大的是hsa-miR-132*,它的差异表达倍数是0.0143032。(1)差异表达的miRNA组成了8个基因簇,分别分布在19号、17号等染色体上。(2)差异表达的miRNA有49个miRNA分布于编码蛋白的内含子区域,1个miRNA位于非编码的内含子区域,49个miRNA分布于基因间。(3)在差异mRNA表达谱搜索已有实验验证和Real-time RT-PCR验证的miRNA的靶基因,hsa-miR-1对应的靶基因是ADPGK、G6PD、TIMP3。hsa-miR-206对应的预测靶基因是G6PD。hsa-miR-155对应的靶基因是CEBPB、CUL4B、RHEB。hsa-miR-16对应的靶基因是MLLT1。hsa-miR-193b*的预测靶基因是TRIM36、SPAG5、WDR18、ALS2CR12GNAS、MRPL37、ALDH2、POLB、ALLC、TRH。hsa-miR-216a的预测mRNA靶基因是ALDH3B1、RTN3、C20orf46、EPS15L1。hsa-miR-487a的预测靶基因是CRAT、HES1、WFDC3、AZI2、SLC25A15、C2orf24、FLOT1、EFNA4、MLLT4、PRDX1、PPIL5。hsa-miR-135a*的预测mRNA靶基因是COQ4、TAOK2。【结论】1.弱精症精子中基因在炎症反应、氧化应激、Wnt信号通路、Toll信号通路等生物学通路存在差异表达。2.弱精症精子mRNA在蛋白代谢及修饰、核酸代谢、信号转导、发育过程、免疫及防御等生物学过程中存在差异表达。3.与物理化学刺激、压力应激、炎症反应、异常代谢、负向调控蛋白激酶、蛋白酶抑制活性等相关的基因在弱精症精子中高表达,可能这些因素是导致精子活力降低的重要诱因;与精子发生、蛋白代谢、线粒体结构与呼吸链组分等相关的基因在健康能育精子中高表达,可能这些因素是保持精子高活力的原因。4.多个miRNA成簇分布,这些miRNA可能协同调控与精子活力相关的一些信号通路。5. G6PD是hsa-miR-1和hsa-miR-206共同的靶基因,这两个miRNA可能通过调节G6PD表达,从而对精子活力有一定调控作用。

全文目录

中文摘要  6-9
英文摘要  9-12
英文缩略词表  12-14
前言  14-19
  1. 影响精子活力的因素  14-16
  2 精子的RNA(mRNA,miRNA)与男性生殖  16-19
技术路线  19-20
第1章弱精症精子m RNA 差异表达谱的构建与分析  20-51
  引言  20
  1.1 材料与方法  20-28
    1.1.1 材料  20-21
    1.1.2 方法  21-28
  1.2 结果  28-42
    1.2.1 高、低活力精子的分离  28-29
    1.2.2 mRNA 基因芯片  29-32
    1.2.3 数据分析  32-42
  1.3 讨论  42-51
    1.3.1 有效分离高、低活力精子  43
    1.3.2 精子活力与信号通路  43-44
    1.3.3 精子活力与能量  44
    1.3.4 与精子活力密切相关的基因  44-51
第2章弱精症精子miRNA 差异表达谱的构建与分析  51-73
  引言  51
  2.1 材料与方法  51-57
    2.1.1 材料  51-53
    2.1.2 方法  53-57
  2.2 结果  57-68
    2.2.1 高、低活力精子的分离  57
    2.2.2 miRNA 基因芯片  57-58
    2.2.3 数据分析  58-62
    2.2.4 Real-time RT-PCR 验证  62-68
  2.3 讨论  68-73
    2.3.1 Real-time RT-PCR 预测靶基因分析  70-71
    2.3.2 miRNA 差异表达谱分析  71
    2.3.3 与精子活力可能相关的miRNA  71-72
    2.3.4 展望  72-73
全文小结  73-74
后期实验计划  74-75
参考文献  75-83
附录  83-109
致谢  109-110
个人简历  110-111

弱精症精子mRNA和miRNA差异表达谱的构建与分析

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