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西北部分地区鸡眼草根瘤菌生物多样性及系统发育研究

作　者: 崔广玲
导　师: 韦革宏
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 微生物学
关键词: 鸡眼草根瘤菌数值分类遗传多样性系统发育
分类号: S154.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本论文综述了根瘤菌多样性、分类和多相分类技术的研究进展;采用表型分析(113项生理生化测定,数值分类)和遗传型分析(16S rDNA PCR-RFLP、nifH PCR-RFLP、nodA PCR-RFLP,16S rRNA、nodA、nifH、recA基因序列分析)等多相分类技术,首次系统地对西北部分地区的53株鸡眼草根瘤菌进行了表型和遗传多样性及系统发育研究,初步确定了鸡眼草根瘤菌的系统发育地位。16S rDNA PCR-RFLP及其序列测定分析表明,所有供试菌株产生了11种16S rDNA基因型,归属于中华根瘤菌属(Sinorhizobium),根瘤菌属(Rhizobium),中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium),土壤杆菌属(Agrobacterium)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)5个系统发育分支上。从鸡眼草根瘤菌中分离出了土壤杆菌,其代表菌株CCNWSX0487、CCNWSX0483及CCNWSX0481与葡萄土壤杆菌(Ag. vitis)的亲缘关系最近,序列相似性为97.19%,但这三株菌与葡萄土壤杆菌(Ag. vitis)有明显差异,构成一个独立的分支,可能预示着新种的出现。此外,CCNWSX0493和CCNWSX0476也构成独立分支,有可能是潜在的新种。recA序列系统发育分析表明,供试菌株归类于土壤杆菌属、根瘤菌属、慢生根瘤菌属和中华根瘤菌属。代表菌株以recA序列为基础的系统发育树与16S rDNA序列分析的系统发育的结果是一致的。但是也存在一定的差异,即代表菌株的recA序列与参比菌株序列同源性均小于其与16S rDNA序列的同源性。nodA PCR-RFLP及其序列分析表明供试菌株分布于慢生根瘤菌属、根瘤菌属、中慢生根瘤菌属和中华根瘤菌属。CCNWSX0493、CCNWGS0088和CCNWSX0476这三株菌的以结瘤基因nodA序列为基础的系统发育树与16S rDNA序列分析的系统发育树存在较大差异。说明nodA基因可能在根瘤菌的不同种间发生了水平转移。nifH PCR-RFLP及其序列分析表明供试菌株分布于慢生根瘤菌属、中慢生根瘤菌属和中华根瘤菌属。供试菌株除CCNWSX0493在16S rDNA序列系统发育树上属于Rhizobium,在固氮基因nifH构建的系统发育树上属于Sinorhizobium之外,其余菌株的nifH基因的系统发育分析与16S rDNA的系统发育分析体现的较为一致,这也说明了西北地区鸡眼草根瘤菌的nifH基因序列具有一定的宿主专一性。对鸡眼草根瘤菌进行113项生理生化指标测试,结果表明不同地理来源,甚至来源于同一地区的不同鸡眼草根瘤菌菌株在碳、氮源利用、耐盐性、对苯酚抗性程度等方面存在着一定差异,12.5%的菌株能耐受300μg/mL氯霉素,58.9%的株菌能耐受2%的NaCl,38%的株菌能耐受700mg/L的苯酚。在数值分类中,所有供试菌株在60%的相似水平上聚在一起。在90%的相似水平上,参比菌株能够按不同的种彼此很好的分开,并将待测菌株主要分为五个表观群:群Ⅰ中华根瘤菌属Sinorhizobium,群Ⅱ根瘤菌属Rhizobium,群Ⅲ慢生根瘤菌Bradyrhizobium,群Ⅳ模式菌株和群Ⅴ土壤杆菌属Agrobacterium。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
第一章文献综述  10-19
  1.1 引言  10-11
  1.2 根瘤菌多样性研究进展  11-15
    1.2.1 根瘤菌表型分类方法  11-13
    1.2.2 根瘤菌遗传型分类方法  13-15
    1.2.3 根瘤菌的系统发育学研究  15
  1.3 根瘤菌的分类进展  15-16
  1.4 本研究的立题依据及研究意义  16-19
    1.4.1 鸡眼草属概述  16-17
    1.4.2 鸡眼草属根瘤菌的国内外研究进展  17
    1.4.3 西北地区鸡眼草属根瘤菌的研究目的及意义  17-19
第二章 16Sr DNA 的PCR-RFL 及其系统发育研究和recA 基因片段系统发育学分析  19-32
  2.1 16S rDNA PCR-RFLP 分析  19-27
    2.1.1 材料与方法  19-23
    2.1.2 结果与分析  23-27
  2.2 16S rDNA 序列的相似性比较及系统发育学分析  27-29
    2.2.1 16S rDNA 序列测定结果和系统发育学分析  27-29
    2.2.2 讨论  29
  2.3 recA 基因片段系统发育学分析  29-32
    2.3.1 材料与方法  29-30
    2.3.2 recA 基因片段序列测定结果和系统发育学分析  30-32
第三章结瘤基因(nodA)和固氮基因（nifH）的PCR-RFLP 分析及系统发育研究  32-46
  3.1 结瘤基因（nodA）限制性片段多样性(PCR-RFLP)研究  33-39
    3.1.1 材料  33
    3.1.2 nodA 基因片段扩增  33-34
    3.1.3 nodA 扩增片段的酶切与电泳  34
    3.1.4 nodA 序列的测定及系统发育树的构建  34
    3.1.5 nodA PCR-RFLP 分析  34-37
    3.1.6 nodA 序列及系统发育树分析  37-39
    3.1.7 讨论  39
  3.2 固氮基因（nifH）限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）研究  39-46
    3.2.1 材料与方法  39
    3.2.2 nifH 片段扩增  39
    3.2.3 nifH 扩增片段的酶切与电泳  39-40
    3.2.4 nifH 的序列测定及系统发育树的构建  40
    3.2.5 nifH PCR-RFLP 分析  40-43
    3.2.6 nifH 序列及系统发育树分析  43-44
    3.2.7 讨论  44-46
第四章鸡眼草根瘤菌的表型多样性及数值分类研究  46-56
  4.1 材料和方法  46-50
    4.1.1 根瘤菌处理  46-47
    4.1.2 生理生化特性测定  47-50
  4.2 实验结果处理  50-51
    4.2.1 性状编码  50
    4.2.2 聚类分类  50
    4.2.3 表观群中心菌株确定  50-51
  4.3 结果与分析  51-55
    4.3.1 生理生化测定结果分析  51-53
    4.3.2 聚类分析结果  53-55
  4.3 讨论  55-56
第五章鸡眼草根瘤菌共生结瘤研究  56-60
  5.1 材料和方法  56-57
    5.1.1 菌种与种子  56
    5.1.2 根瘤菌的回接方法  56-57
    5.1.3 观察记录  57
  5.2 结果与分析  57-60
第六章讨论与结论  60-63
  6.1 西北地区鸡眼草根瘤菌的生物多样性  60
  6.2 结论  60-63
参考文献  63-68
附录  68-72
缩略词  72-73
致谢  73-74
作者简介  74

西北部分地区鸡眼草根瘤菌生物多样性及系统发育研究

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