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龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）M4018中rex基因的克隆、表达和生物功能初步研究

作　者: 沈晶
导　师: 郭美锦
学　校: 华东理工大学
专　业: 微生物学
关键词: Sr-Rex蛋白龟裂链霉菌M4018 ROP 凝胶阻滞迁移分析生物学活性
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

Rex (Redox regulator, Rex)是第一个直接响应胞内NADH/NAD+平衡的转录调节因子,广泛存在于革兰氏阳性菌中,最先在天蓝色链霉菌中发现。Rex调节系统作为新近发现的一种胞内氧化还原状态调节机制,对其研究并不是很多。为此,本文对土霉素生产菌——龟裂链霉菌(S. rimosus) M4018中的Rex进行基因克隆、表达和生物学活性研究。从S. rimosus M4018基因组中克隆到rex基因,测序后经过NCBI的BLAST比对发现是Rex蛋白家族中新的一员,命名为Sr-Rex。与链霉菌属的其他已报导菌中的rex基因有较高的同源性,如Streptomyces coelicolor A3 (2),84%, Streptomyces avermitilis MA-4680,84%, Streptomyces griseus,80%, Streptomyces lividans TK24,71%,获得GenBnak登录号：GQ849479。序列分析表明rex基因编码281个氨基酸的多肽,推测其分子量大约为29.2kDa,等电点为5.17。利用TaRaKa Genome Walking Kit克隆得到与Rex相互结合作用的部分操纵子(?))NA (Rex operator, ROP)序列,该ROP核苷酸序列比对发现其与S. coelicolor中ROP完全一致。为了体外得到Sr-Rex蛋白,构建重组表达菌E. coli BL21 (DE3)/pET28a-rex(his-Tag),并通过对培养基、最适诱导时间、IPTG最佳浓度、最适诱导温度等表达条件的一系列优化,确定Sr-Rex蛋白的最佳表达条件：菌浓OD600达到约0.5时,添加诱导剂IPTG浓度0.5mmol/L,在37℃和220rpm振荡培养5h。通过镍柱亲和层析和阴离子交换层析,得到纯度达99%的Sr-Rex蛋白,测得浓度为2.35mg/mL。进一步,通过合成不同长度的ROP寡核苷酸与Sr-Rex进行生物活性结合试验,EMSA结果证实ROP必须是一段完整的反向重复序列,缺失任何一臂都会使其失去结合活性,并确定与Sr-Rex结合活性最核心的ROP序列为：CATCTTTGTGCACGCGTTCACAAAGACA。同时,通过一系列EMSA试验表明Sr-Rex蛋白能特异性结合ROP序列,但两者的结合受NADH的浓度影响,NADH浓度越高两者的结合越差,但NAD+则几乎不影响两者的结合。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-11
第一章前言  11-25
  1.1 链霉菌简介  11-13
    1.1.1 龟裂链霉菌遗传研究概况  12-13
  1.2 细菌胞内氧化还原状态研究  13
  1.3 细菌胞内氧化还原传感器(Redox sensor)的研究  13-24
    1.3.1 硫醇氧化还原传感器  13-16
    1.3.2 Fe-S簇传感器  16-19
    1.3.3 黄素辅因子氧化还原传感器  19-21
    1.3.4 醌氧化还原传感器  21-22
    1.3.5 吡啶核苷酸  22-24
  1.4 本课题的研究内容及意义  24-25
第二章材料与方法  25-33
  2.1 实验材料  25-27
    2.1.1 菌种与质粒  25
    2.1.2 培养基配方  25
    2.1.3 实验试剂  25-26
    2.1.4 引物  26
    2.1.5 实验仪器  26-27
  2.2 实验方法  27-33
    2.2.1 分子生物学实验  27-30
    2.2.2 菌种的甘油管保存  30
    2.2.3 蛋白电泳  30-31
    2.2.4 蛋白纯化  31
    2.2.5 蛋白浓度测定  31-32
    2.2.6 凝胶阻滞实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)  32-33
第三章龟裂链霉菌(S.rimosus M4018)rex基因与ROP片段的克隆与序列分析  33-44
  3.1 S.rimosus M4018中rex基因的克隆  35-36
    3.1.1 PCR扩增rex基因  35-36
  3.2 rex基因连接载体pMD19-T并转化大肠杆菌(E.coli)DH5α  36-37
  3.3 序列分析  37-42
  3.4 ROP片段的克隆与测序  42-43
  3.5 小结  43-44
第四章龟裂链霉菌(S.rimosus)M4018Rex蛋白在E.coli中表达与纯化  44-54
  4.1 pET28a-rex(his-Tag)重组表达质粒的构建  44-46
    4.1.1 载体pET28a的线性化  44-45
    4.1.2 rex(his-Tag)基因的获得  45
    4.1.3 pET28a-rex(his-Tag)的构建和转化  45-46
  4.2 Sr-Rex蛋白的表达及条件优化  46-50
    4.2.1 Sr-Rex蛋白的诱导表达  46
    4.2.2 Sr-Rex蛋白表达条件优化  46-50
  4.3 Sr-Rex蛋白的纯化  50-52
    4.3.1 Sr-Rex蛋白的Ni-NTA亲和层析  50-51
    4.3.2 DEAE阴离子交换层析  51-52
  4.4 Sr-Rex蛋白浓度测定  52
  4.5 讨论  52-53
  4.6 小结  53-54
第五章龟裂链霉菌(S.rimosus)M4018 Rex蛋白性质及功能分析  54-62
  5.1 圆二色谱测定Sr-Rex二级结构  55-56
  5.2 凝胶阻滞分析(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)Sr-Rex:ROP生物学活性  56-61
    5.2.1 Sr-Rex能结合其启动子序列  56-57
    5.2.2 Sr-Rex蛋白与DNA特异性结合位点的确定  57-58
    5.2.3 Sr-Rex蛋白与ROP序列的结合活性  58-59
    5.2.4 NADH和NAD~+对Sr-Rex蛋白与ROP序列的结合活性的影响  59-60
    5.2.5 Sr-Rex与ROP结合的分子模拟图结果  60-61
  5.3 小结  61-62
第六章讨论与结论  62-67
  6.1 讨论  62-65
    6.1.1 来源于链霉菌属中S.coelicolor A3(2)的Rex调节机制  62-63
    6.1.2 来源于嗜热菌T-Rex与枯草芽孢杆菌B-Rex的晶体结构特点分析  63-64
    6.1.3 来源于S.rimosus M4018中Sr-Rex与已知Rex的比较  64-65
  6.2 结论  65-66
  6.3 展望  66-67
    6.3.1 Sr-Rex蛋白结构的研究  66
    6.3.2 Rex蛋白应用  66-67
参考文献  67-74
致谢  74

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