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暗诱导衰老小麦叶片内一种耐热蛋白水解酶的分离纯化及其生化特性鉴定

作　者: 王晓媛
导　师: 徐朗莱
学　校: 南京农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 小麦叶片暗诱导衰老蛋白水解酶热稳定性生化特性纯化蛋白质降解质谱分析
分类号: Q946
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

植物体内的蛋白水解酶在植物的生长发育、衰老及在外界环境胁迫下的生理适应活动过程中都发挥着重要的作用，尤其在植物叶片的衰老过程中，叶片中蛋白水解酶同工酶的合成量及其活性都会有显著的提高。本实验室多年来一直致力于植物叶片衰老过程中蛋白水解酶同工酶变化的研究，在以小麦为材料的研究中发现小麦衰老期间叶片内存在多种与衰老相关的蛋白水解酶同工酶，并在对这些蛋白水解酶的生化特性进一步研究中，还发现了其中有一种性质很特殊的蛋白水解酶同工酶，它在小麦生长幼苗期和衰老期间都有活性，但在衰老期间其活性会显著上升，尤其是该蛋白水解酶具有良好的热稳定性。为了更深入的研究这种蛋白水解酶同工酶，本实验以暗诱导衰老的小麦叶片为材料，通过生物化学的研究方法和手段，对这种蛋白水解酶进行了分离纯化和生化特性的研究，其主要的研究内容及结果叙述如下：1、暗诱导衰老小麦叶片内一种耐热蛋白水解酶的初步分离纯化及其生化特性鉴定本研究以暗诱导衰老48h的小麦（Triticum aestivum L. cv. Yangmai 158）叶片为材料，采用30％-50％饱和度的硫酸铵沉淀，凝胶层析脱盐后进行聚丙烯酰胺凝胶蛋白水解酶同工酶活性电泳，再直接切胶用回收槽电洗脱回收方法，初步分离鉴定出了这种耐热的蛋白水解酶同工酶。用蛋白水解酶活性电泳法检测上述回收槽电洗脱回收的样品，结果显示只有一条明显的蛋白水解酶同工酶条带，但普通梯度凝胶电泳的结果显示该回收样品中还存在少许杂蛋白。另外，我们对该酶的一些基本的生化特性也进行了研究，结果显示该酶具有良好的热稳定性，分离纯化后的酶液在0到60℃温度下处理1 h后进行蛋白酶活性电泳，其活性无明显变化，在70℃温浴下处理1 h后仍有部分活性。且该酶还表现出相当宽的pH稳定范围，电泳后的凝胶在pH 3.0或pH 10.0和80℃条件下处理2 h，该酶还存在一定的活性。研究结果显示该酶的最适温度为50℃，最适pH约为8.0．酸性蛋白酶抑制剂pepstatin、金属蛋白酶抑制剂EDTA和1’10-Phenanthroline以及半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64都不能抑制这种蛋白水解酶同工酶的活性，但丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF能部分抑制该酶的活性。上述的纯化方案操作比较简单，且相对于常规的纯化比较经济，但纯化后的酶液内还具有少量的杂蛋白。因此，我们在上面实验的基础上，对有关纯化方法和过程进行了进一步的优化。具体的方法和步骤如下：以暗诱导衰老48h的小麦叶片为材料，匀浆后离心取上清液（即粗酶液），粗酶液于33℃，pH5.5的条件下温浴1h，电泳后的染色结果显示：上述温浴处理后的粗酶液中杂蛋白（尤其是1，5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶）的含量明显减少；处理后的酶液先进行硫酸铵分级沉淀（饱和度为30％-50％），凝胶层析脱盐后进行DEAE阴离子交换柱层析分离；收集酶活性组分透析后通过Q-sepharose fast flow柱进行层析分离；收集蛋白水解酶活性组分经聚丙烯酰胺凝胶蛋白水解酶活性电泳分离后，再采用直接切胶用回收槽电洗脱回收方法，最后分离纯化出了该种耐热的蛋白水解酶，蛋白水解酶活性电泳和梯度凝胶蛋白质电泳结果显示都为一条带。对纯化得到的该酶进行生物化学特性鉴定，结果发现该酶的最适温度为55℃左右，在75℃时处理1h后仍有37％左右的活性；该酶的最适pH约为8.0；10 mmol·L^-1丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF处理大约能抑制该酶活性的60％，而酸性蛋白酶抑制剂pepstaliIl、金属蛋白酶抑制剂EDTA和EGTA、半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64处理同样也显示都不能抑制这种蛋白水解酶的活性。对该纯酶样品进行质谱鉴定分析，其结果显示该蛋白酶与谷胱甘肽还原酶有较好的同源性关系。另外，我们的研究还发现在其他植物（油菜，白菜，烟草，土豆，番茄）叶片中都有耐热蛋白水解酶的存在，且它们的分子量和小麦的相比也很相近。本课题研究和其结果为今后这种蛋白水解酶的抗体制备奠定了坚实的基础，更为能够深入地去研究了解这种耐热的蛋白水解酶在小麦叶片中的细胞定位、生理生化功能和在其它植物叶片中的普遍性及在衰老叶片内蛋白质彻底降解的机制等都奠定了一个良好而扎实的基础。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
缩略词对照表  9-10
前言  10-12
文献综述  12-23
  一植物体内的蛋白水解酶  12-23
    1 蛋白水解酶的类型及作用  12-15
    2 蛋白水解酶的定位及降解机理  15-18
    3 内肽酶与植物衰老  18-21
    4 内肽酶的研究方法  21-23
实验部分  23-48
  第一章暗诱导衰老小麦叶片内一种耐热蛋白水解酶的初步分离及其生化特性鉴定  23-31
    1 材料与方法  24-26
    2 结果与分析  26-31
  第二章暗诱导衰老小麦叶片内一种耐热蛋白水解酶的分离纯化及其生化特性鉴定  31-44
    1 材料与方法  31-34
    2 结果与分析  34-44
  第三章讨论  44-48
参考文献  48-57
攻读学位期间发表的论文  57-58
全文总结  58-59
创新点  59-60
致谢  60

暗诱导衰老小麦叶片内一种耐热蛋白水解酶的分离纯化及其生化特性鉴定

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