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新生鼠暴露低剂量毒死蜱后对脂多糖所致免疫反应的影响

作　者: 谷芬
导　师: 赵玲玲
学　校: 中南大学
专　业: 儿科学
关键词: 有机磷农药毒死蜱脂多糖免疫 SD新生鼠
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

农药污染是环境污染的重要构成之一,有机磷农药毒死蜱是全世界使用最广泛的农药之一。近年来有研究发现短期暴露于一定剂量毒死蜱,不会抑制乙酰胆碱酯酶的活性,但可引起大鼠T淋巴细胞功能受损。我们前期研究显示,SD新生鼠在胶质细胞发育高峰期(出生后11～14天)暴露低剂量毒死蜱可诱导中脑黑质小胶质细胞活化并导致中脑TNF-α表达上调。儿童对于环境有害因素较成人更为易感,相同的暴露对儿童会产生更严重而持久的损害,特别是对发育中的脑组织可能造成严重的甚至是永久性损害。因此,积极研究毒死蜱等环境化学污染物对儿童生长发育脑的影响及相关机制,有望为防治儿童中枢神经系统疾病提供思路,并为制定农药残留标准提供依据。免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成。T淋巴细胞是具有多功能的细胞群体,CD4+和CD8+是成熟T淋巴细胞不同亚群的表面标志,代表两类重要的细胞亚群。CD4+为辅助性T淋巴细胞,能促进B淋巴细胞、T淋巴细胞和其他免疫细胞的增殖和分化,协调免疫细胞间的相互作用；CD8+为抑制性T淋巴细胞,可抑制免疫应答活化期。在正常情况下,CD4+与CD8+保持一定的比例,二者之间相互诱导,相互制约,其数目异常或比例倒置,均可导致细胞免疫功能紊乱和免疫失调。补体是免疫分子重要的组成部分,是存在于血清和组织液中一组具有酶活性的蛋白质,由30多种可溶性蛋白和膜结合蛋白组成。它广泛参与机体抗微生物的免疫反应、免疫调节、免疫损伤以及移植排异等。C4d是补体C4的片段,参与补体经典途径的激活。星形胶质细胞是脑中数量最多的细胞,在神经免疫调节中发挥重要作用。S100 Calcium-bingding proein Beta(以下简称S100B蛋白)是脑胶质细胞的特异性蛋白,在中枢神经系统主要集中星形胶质细胞内,可作为心肺复苏后及宫内生长迟缓新生儿神经系统恢复的预测指标。免疫激发状态是指机体受外界刺激所激发的机体免疫反应的状态,免疫激发是免疫反应的初始环节。脂多糖是革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要成分,具有多种生物学活性和免疫学特性,对机体有很强的毒性和抗原性。当机体受到脂多糖刺激,可直接或间接激活细胞产生大量细胞因子,这些细胞因子可激活补体,发挥免疫调节作用,在疾病发生中介导宿主炎症反应和免疫应激反应的发生,常作为免疫刺激剂来模拟机体免疫应激状态。体外实验研究发现,有机磷农药毒死蜱代谢物联合脂多糖可致IFN-γ表达增加,但低剂量毒死蜱基础上对脂多糖致新生鼠脑组织及全身免疫系统改变的研究尚无文献报导。在本实验中,我们以新生鼠为研究对象,建立脂多糖致新生鼠免疫激发状态动物模型,参考课题组前期实验方法建立暴露低剂量毒死蜱模型,通过流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+变化,免疫组织化学检测中脑黑质C4d的表达,免疫组织化学和WesternBlotting方法检测中脑黑质S100B蛋白的表达,研究SD新生鼠在暴露低剂量毒死蜱基础上对脂多糖所致免疫反应的影响。一、脂多糖致新生鼠免疫激发状态动物模型的建立目的：建立一种简单可靠的模拟机体免疫激发状态的动物模型。方法：出生11天SD大鼠36只,随机分为生理盐水对照组(n=18)及脂多糖实验组(n=18)。实验组于生后第15天腹腔注射一次1mg／ml的脂多糖,给药体积为lml／kg,生理盐水对照组予等体积生理盐水代替。建立模型后6h、30h、54h分别在相应时间点处死。实验取材时3个时间点两组大鼠均制备脑组织石蜡切片行中脑黑质C4d免疫组织化学检测,其中6h时间点两组大鼠在生理盐水灌注前先予心脏采血用于流式细胞术分析。以注射脂多糖后6h是否引起外周血T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+及54h内中脑补体C4d变化判断模型建立成功与否。结果：①外周血T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+：实验组外周血CD4+细胞数值较对照组减少,CD8+细胞数值较对照组增加,CD4+／CD8+细胞比值较对照组下降(P<0.05)；②中脑黑质C4d：6h、30h不表达,54h实验组表达较对照组明显增加(P<0.05)。结论：脂多糖可诱导致新生鼠免疫激发状态,表现为外周血T淋巴细胞亚群CD4+细胞数值减少,CD8+细胞数值增加,CD4+／CD8+细胞比值下降；中脑补体C4d表达增加。建立了一种简单可靠的由脂多糖诱导的免疫激发状态的动物模型。二、毒死蜱对脂多糖致新生鼠外周血CD4+、CD8+及中脑C4d、S100B蛋白表达的影响目的：观察SD新生鼠在暴露低剂量毒死蜱基础上对脂多糖致外周血CD4+、CD8+及中脑C4d、S100B蛋白表达的影响。方法：出生11天SD大鼠180只,随机分为对照组(n=72)及实验组(n=108),对照组又分为生理盐水组、二甲基亚砜组,实验组分为毒死蜱组、脂多糖组、毒死蜱加脂多糖组。毒死蜱组、毒死蜱加脂多糖组从大鼠出生11天起,经腹部皮下注射毒死蜱(溶解于二甲基亚砜中,浓度为5mg／ml),给药体积为1ml／kg,每天一次,连续注射4天,建立暴露低剂量毒死蜱SD新生鼠动物模型。对照组二甲基亚砜组和生理盐水组分别予等体积二甲基亚砜和生理盐水代替。毒死蜱加脂多糖组注射毒死蜱后18h按第一部分方法建立脂多糖动物模型,脂多糖组在生后15天按第一部分方法建立脂多糖动物模型。对照组二甲基亚砜组、生理盐水组分别予等体积生理盐水代替。建立脂多糖模型后6h、30h、54h分别在相应时间点处死。实验取材时每组动物每个时间点取脑用于中脑C4d、S100B蛋白免疫组织化学方法及中脑S100B蛋白Western-blotting方法检测；其中6h时间点各组大鼠在生理盐水灌注前先予心脏采血用于流式细胞术分析。实验动物注射毒死蜱后严密观察12h是否有急性有机磷农药中毒症状(如抽搐、震颤、流涎、呼吸抑制、死亡等)。结果：①注射毒死蜱后未见急性有机磷农药中毒症状。②外周血T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+：毒死蜱组外周血CD4+细胞数值较对照组减少,CD8+细胞数值较对照组增加,CD4+／CD8+细胞比值较对照组下降(P<0.05)；毒死蜱加脂多糖组外周血CD4+细胞数值较对照组减少,CD8+细胞数值较对照组增加,CD4+／CD8+细胞比值较对照组下降(P<0.05)；毒死蜱加脂多糖组CD4+、CD8+细胞数值较单独脂多糖组明显减少,CD4+／CD8+细胞比值较单独脂多糖组明显下降(P<0.05)；二甲基亚砜组外周血CD4+细胞数值、CD8+细胞数值、CD4+／CD8+细胞比值与生理盐水组比较,P>0.05。③中脑黑质C4d：6h、30h不表达,54h毒死蜱组表达较对照组明显增加；毒死蜱加脂多糖组表达较对照组明显增加,较单独脂多糖组明显减少(P<0.05)；二甲基亚砜组C4d表达与生理盐水组比较,P>0.05。④中脑黑质S100B蛋白：毒死蜱组表达较对照组明显增加,脂多糖组表达较生理盐水对照组明显增加,毒死蜱加脂多糖组表达较对照组明显增加,较单独脂多糖组明显减少(P<0.05)。各实验组S100B蛋白各自在3个时间点比较,呈时间依赖性增加(P<0.05)；各时间点二甲基亚砜组S100B蛋白与生理盐水组比较,P>0.05。结论：①低剂量毒死蜱可减弱SD新生鼠对脂多糖所致的免疫反应,表现为外周血T淋巴细胞亚群CD4+细胞数值、CD8+细胞数值减少,CD4+／CD8+细胞比值下降；中脑补体C4d和S100B蛋白表达减少。②免疫功能紊乱是毒死蜱产生神经发育毒性作用的一个可能机制之

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摘要  5-9
ABSTRACT  9-14
目录  14-15
英文缩写注释  15-16
前言  16-19
第1章脂多糖致新生鼠免疫激发状态动物模型的建立  19-26
  1.1 材料与方法  19-24
    1.1.1 材料  19-20
    1.1.2 方法  20-24
  1.2 实验结果  24-26
    1.2.1 外周血T淋巴细胞亚群CD_4~+、CD_8~+表达水平  24-25
    1.2.2 C_(4d)表达水平  25-26
第2章毒死蜱对脂多糖致新生鼠外周血CD_4~+、CD_8~+及中脑C_(4d)、S100B蛋白表达的影响  26-40
  2.1 材料与方法  26-34
    2.1.1 材料  26-28
    2.1.2 方法  28-34
  2.2 实验结果  34-40
    2.2.1 一般情况观察  34
    2.2.2 外周血T淋巴细胞亚群CD_4~+、CD_8~+表达水平  34-36
    2.2.3 C_(4d)表达水平  36
    2.2.4 S100B蛋白表达水平  36-40
第3章讨论  40-45
第4章结论  45-46
参考文献  46-52
附图  52-54
综述  54-67
致谢  67-68
攻读硕士学位期间论文发表和参与课题  68

新生鼠暴露低剂量毒死蜱后对脂多糖所致免疫反应的影响

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