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栀子多元多息指纹图谱的构建

作　者: 王清波
导　师: 鲁耀邦
学　校: 湖南中医药大学
专　业: 中药学
关键词: 栀子 ISSR SDS-PAGE POD-PAGE EST-PAGE 栀子苷 HPLC
分类号: R284.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 25次
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内容摘要

栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实,药材主要产于湖南、江西、湖北、浙江及福建等地,系湖南产道地药材之一。其味苦性寒,主归心、肺、三焦经,具有泻火除烦,清热利尿,凉血解毒等功效,临床广泛用于热病心烦,黄疸尿赤,血淋涩痛,血热吐衄,目赤肿痛,火毒疮疡等证。虽然自汉书记载有栽培栀子以来已有两千多年的栽种历史,但由于上个世纪六、七十年代开垦荒地破坏了大量的野生资源,加之目前栀子应用前景十分广阔,市场需求量大,单纯依靠野生栀子难以满足市场需求。因此,各主要产区纷纷建立了栀子的GAP药材种植基地。但由于栀子品种较多,来源除有野生、庭院栽培及GAP基地种植外,市场上还有《中国药典》未予收载的水栀子混迹期间,使得市场上栀子的品质良莠不齐。为正确评价目前临床上使用的栀子的资源与质量,本课题利用多种现代分子生物学技术,从DNA、蛋白质和化学成分诸方面构建了中药栀子多元多息指纹图谱的鉴别方法和体系,为栀子品质评价和资源的开发和可持续利用提供实验依据。本课题主要研究内容与结果如下：1.应用ISSR标记,构建了栀子的ISSR标记的DNA指纹图谱,并结合系统聚类分析方法对不同产地的12份材料进行分析研究。结果表明,12个引物共扩增出126个位点,其中多态性位点92个,多态位点百分率为73.02%；观测等位基因数(Na)1.7302,有效等位基因数(Ne)1.4643；Nei’s基因多样性(He)27.09%；Shannon’s信息指数(I)0.4027；UPGMA聚类分析可将所有样品分为4类,聚类结果显示栀子种质亲缘关系与地理分布有明显相关性,可以看出来源于同一地区的部分栀子种质聚在一起,呈现出一定的地域性分布规律。2.利用聚丙烯酰胺凝胶电泳构建了不同产地的栀子蛋白质电泳指纹图谱。结果表明,通过蛋白质指纹图谱可将不同产地栀子区分开来。3.进一步研究了栀子中的一类特殊蛋白质——同工酶,构建了栀子过氧化氢酶和酯酶酶谱。结果表明,12种栀子种质的遗传相似系数在0.4286-0.9048之间,种质间遗传关系比较近,但存在一定的变异,与DNA指纹图谱的结果基本一致。4.利用HPLC法对不同产地、不同类型栀子药材中栀子苷的含量进行了测定。结果显示,GAP基地药材中栀子苷含量比野生药材要高,含量波动要小,稳定,且远高于《中国药典》标准。不同产地的栀子中栀子苷的含量差异显著。部分药材栀子苷含量低于《中国药典》标准。

全文目录

中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
引言  10-13
正文  13-57
  1 材料与方法  13-29
    1.1 栀子DNA指纹图谱的构建  13-18
      1.1.1 栀子基因组DNA提取和浓度测定  15-16
      1.1.2 栀子ISSR指纹图谱分析  16-17
      1.1.3 不同产地栀子的遗传多样性分析  17-18
    1.2 栀子蛋白质指纹图谱的构建  18-27
      1.2.1 栀子可溶性蛋白质指纹图谱的构建  21-24
      1.2.2 栀子同工酶酶谱的构建  24-27
    1.3 不同产地栀子药材中栀子苷含量测定  27-29
      1.3.1 色谱条件  27-28
      1.3.2 供试品溶液制备  28
      1.3.3 对照品溶液制备  28
      1.3.4 线性关系考察  28
      1.3.5 精密度试验  28
      1.3.6 稳定性试验  28
      1.3.7 重复性试验  28-29
      1.3.8 加样回收率试验  29
      1.3.9 样品测定  29
  2 结果与分析  29-44
    2.1 栀子DNA指纹图谱  29-35
      2.1.1 栀子总DNA的检测结果  29
      2.1.2 栀子ISSR反应体系的优化  29-32
      2.1.3 PCR扩增结果  32-33
      2.1.4 基于ISSR的聚类分析结果  33-35
    2.2 栀子蛋白质指纹图谱  35-37
      2.2.1 栀子可溶性蛋白质的提取及浓度测定结果  35-36
      2.2.2 凝胶染色方法筛选结果  36-37
      2.2.3 凝胶图谱分析  37
    2.3 栀子同工酶酶谱  37-41
      2.3.1 栀子同工酶酶液提取优化  37-38
      2.3.2 不同栀子的同工酶电泳结果  38-39
      2.3.3 酶带数及迁移率分析  39
      2.3.4 聚类分析  39-41
      2.3.5 聚类结果的Mantel检验  41
    2.4 不同产地栀子药材中栀子苷含量测定  41-44
      2.4.1 线性关系考察  41-42
      2.4.2 精密度试验  42
      2.4.3 稳定性试验  42-43
      2.4.4 重复性试验  43
      2.4.5 加样回收率试验  43
      2.4.6 样品测定  43-44
  3 讨论  44-48
    3.1 栀子总DNA的提取  44
    3.2 PCR反应问题的排查策略  44-45
    3.3 凝胶制备及蛋白凝胶染色问题  45-46
    3.4 多元多息指纹图谱鉴别的意义及趋势  46-47
    3.5 多元多息指纹图谱鉴别与中药活性成分的关系  47-48
  4 结论  48-49
  5 图版与说明  49-57
致谢  57-58
参考文献  58-61
附录栀子及其混淆品水栀子的多元鉴别  61-72
攻读硕士学位期间所发表的论文  72

栀子多元多息指纹图谱的构建

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