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解磷细菌K_3的GFP标记与在土壤中定殖及对玉米生长效应研究

作　者: 李晓婷
导　师: 徐阳春
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物营养
关键词: 解磷细菌 GFP 玉米定殖
分类号: S513
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 42次
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内容摘要

本文采用GFP标记解磷细菌K3获得了标记菌株K3GFP,通过液体摇瓶试验、根盒试验和盆栽试验,研究了其在NBRIP培养液中解磷效果、根际土壤中的定殖状况及对玉米生长的影响。主要获得了如下结果：(1)将构建的含有假单胞菌属自身启动子及绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒pTRGFP电转至解磷细菌K3中,获得了发光稳定的标记菌株K3GFP。激光共聚焦显微镜观测和质粒检测显示菌株K3GFP具有较强的荧光。(2)在LB液体培养基中的生长曲线表明,K3GFP进入对数期的时间比出发菌株K3稍慢；7d液体摇瓶试验表明,菌株K3GFP对Ca3(PO4)2的解磷量在第4d达到最高774μg／mL,而菌株K3在第3d就达到了最大含量780μg／mL,两个试验均证明pTRGFP质粒的转入对K3菌株解磷能力稍有影响。标记菌株K3GFP施入自然土壤,其数量在10d后为5.47×106～2.40×106CFU／g土左右,在40d后保持在5.0×103 CFU／g土左右,说明解磷细菌K3GFP可以在自然土壤中定殖。(3)玉米苗期根盒试验结果表明,菌株K3GFP在根际土的定殖数量比非根际土多,但根际土和非根际土中的定殖数量随着时间延长而下降,30d后根际土中标记菌株K3GFP的数量维持在104 CFU／g土左右。通过激光共聚焦扫描显微镜检测玉米根表中菌株K3GFP的定殖情况发现,接种处理表现出明显的强荧光。标记菌株K3GFP促进了苗期玉米的生长,玉米的株高、鲜重、干重分别比对照增加4.58%、6.61%、7.89%,植株吸磷量增加了29.74%,说明接种解磷细菌促进了玉米生长及其对磷的吸收。(4)盆栽试验结果表明：土壤中K3GFP菌株的数量随玉米的生长呈下降趋势,苗期与大喇叭口期基本维持在104～105 CFU／g土。M+K3与M+K3G处理增加了土壤中细菌与放线菌的数量,抑制了真菌的生长。DGGE图谱及群落相似性指数分析显示,M+K3以及M+K3G处理与对照微生物多样性差异较大,解磷细菌可能导致土壤微生物群落发生较大变化。在玉米各个生育期,M+K3与M+K3G处理的植株株高、生物量、全磷含量以及土壤有效磷含量与对照差异显著,M+K3与M+K3G处理与有机肥处理差异显著,M+K3与M+K3G处理间在有的时期差异显著,说明在盆栽试验中,质粒pTRGFP的导入对出发菌株的解磷效果有些影响,标记菌株K3GFP的解磷效果比出发菌株K3的解磷效果较弱,同时也说明解磷细菌提高了土壤中有效磷含量,增加了玉米植株磷累积量,促进了玉米生长。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
第一章文献综述  12-30
  1 研究意义  12
  2 溶磷微生物与植物生长  12-16
    2.1 溶磷微生物  12-14
      2.1.1 解磷微生物的种类与生态分布  13
      2.1.2 解磷微生物的解磷机理  13-14
      2.1.3 解磷微生物的解磷能力研究  14
    2.2 根际-解磷微生物  14-15
    2.3 根际-解磷微生物系统中解磷菌对植物的生长影响  15-16
      2.3.1 固定氮素,释放难溶性矿质中的营养元素,提高植物生长  15-16
      2.3.2 提高植物的抗逆性,提供了物理屏障,减少病原菌侵害,减少毒性  16
      2.3.3 产生植物激素  16
  3 溶磷微生物的根际定殖  16-18
    3.1 影响溶磷微生物定殖的因素  16-17
    3.2 溶磷微生物根际定殖的检测  17-18
  4 植物根际-微生物系统中绿色荧光蛋白的应用  18-28
    4.1 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein GFP)的性质  19-20
    4.2 绿色荧光蛋白的优缺点  20-21
    4.3 绿色荧光蛋白的标记方式  21-22
      4.3.1 表达质粒标记  21-22
      4.3.2 染色体同源重组  22
      4.3.3 转座重组标记  22
    4.4 绿色荧光蛋白标记菌株的检测方法  22-24
      4.4.1 荧光显微镜  23
      4.4.2 激光共聚焦扫描显微镜  23-24
    4.5 绿色荧光蛋白的应用  24-28
      4.5.1 GFP标记微生物后对微生物生理生化的影响  25-26
      4.5.2 GFP标记微生物在作物根际定殖研究  26-28
  5 技术路线  28-30
第二章解磷细菌K_3的GFP标记菌株的构建及其解磷能力比较  30-40
  1 材料与方法  30-33
    1.1 供试材料  30-31
    1.2 方法  31-33
  2 结果与分析  33-38
    2.1 标记菌株K_3GFP的构建与荧光检测  33-34
    2.2 标记菌株K_3GFP的质粒检测  34
    2.3 标记菌株K_3GFP的稳定性  34-35
    2.4 菌株K_3与K_3GFP的生长动态的比较  35
    2.5 菌株K_3与K_3GFP的解磷效果比较  35-37
    2.6 标记菌株K_3GFP在土壤中的存活  37-38
  3 讨论  38-39
  4 小结  39-40
第三章标记菌株在玉米苗期根际定殖的研究  40-48
  1 材料与方法  40-42
    1.1 试验材料  40-41
    1.2 试验方法  41-42
      1.2.1 玉米的根盒栽培  41
      1.2.2 采样时间与采样方法  41
      1.2.3 测定项目及方法  41-42
  2 结果与分析  42-45
    2.1 接种标记菌株K_3GFP对玉米生长的影响  42-43
    2.2 接种标记菌株K_3GFP对土壤有效磷与玉米全磷含量的影响  43
    2.3 玉米苗期标记菌株K_3GFP在土壤中的变化  43-44
    2.4 玉米苗期标记菌株K_3GFP在根际土中的定殖情况  44-45
  3 讨论  45-46
  4 小结  46-48
第四章标记菌株在玉米生育期的动态变化及对玉米生长的影响  48-64
  1 材料与方法  48-51
    1.1 试验材料  48
    1.2 试验方法  48-51
      1.2.1 盆栽试验方案  48-49
      1.2.2 采样时间及方法  49
      1.2.3 测定项目与方法  49-51
        1.2.3.1 植株地上高度测定与干重测定  49
        1.2.3.2 植株磷含量测定与土壤有效磷含量测定  49
        1.2.3.3 土壤中解磷细菌的分布  49
        1.2.3.4 土壤中标记解磷细菌的分布  49
        1.2.3.5 土壤中微生物群落测定  49-51
    1.3 数据处理方法  51
  2 结果与分析  51-61
    2.1 标记菌株K3GFP在玉米不同生育期根际土与非根际土中的变化  51
    2.2 解磷细菌在玉米根际的分布  51-52
    2.3 不同处理在苗期与成熟期对可培养微生物区系的影响  52-53
    2.4 米苗期各处理对微生物群落相似性的影响  53-57
      2.4.1 苗期土壤微生物群落DGGE图谱分析  54-55
      2.4.2 苗期根际土与非根际士的微生物群落相似性分析  55-57
    2.5 不同处理对株高的影响  57
    2.6 不同处理对玉米地上部与地下部的生物量  57-59
    2.7 不同处理对土壤有效磷含量的影响  59
    2.8 不同处理对玉米植株磷累积量的影响  59-61
  3 讨论  61-63
  4 小结  63-64
全文总结  64-66
参考文献  66-76
致谢  76

解磷细菌K_3的GFP标记与在土壤中定殖及对玉米生长效应研究

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