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猪链球菌2型毒力岛的检测及trag基因缺失株的构建

作　者: 张慧
导　师: 范红结
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪链球菌2型毒力岛检测 trag基因基因敲除溶血素Ⅲ相关膜蛋白
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

猪链球菌(Streptococcus suis)是一种革兰氏阳性、兼性厌氧的球菌。可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症,同时可引起人中毒性休克综合征,感染后遗症包括失聪和关节炎,是一种重要的人畜共患病病原。根据其荚膜多糖抗原性的差异,分为35个血清型(1-34,1／2)及相当数量无法定型的菌株。菌株之间在毒力上存在着很大的差异,致病性强弱与其毒力岛的存在与否有很大关系。本研究以毒力最强、危害最严重、流行最广泛的猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2, SS2)为研究对象,构建了感染相关因子trag基因的缺失株,通过动物模型评价了该突变株的毒力。同时,对于新发现的89K毒力岛,PCR检测了其在不同来源、不同血清型、不同地区的猪链球菌上的分布。1猪源毒力岛89K的检测根据新发现的89K毒力岛的序列设计引物,PCR检测此毒力岛在不同来源、不同血清型、不同地区的猪链球菌上的分布。结果表明,在40株不同来源、不同血清型的菌株中,只有12株含有89K毒力岛,且均为猪链球菌2型,其中两株为人源株,其他为猪源株。在猪链球菌9型和马兽疫亚种中均为阴性。2猪链球菌2型trag基因缺失株的构建根据猪链球菌2型人源98HAH33菌株全基因序列设计引物,构建中间为壮观霉素抗性基因,两侧为trag编码基因上、下游同源序列的基因敲除载体,通过同源重组构建trag基因缺失的突变株。PCR鉴定显示获得1株trag基因被敲除的突变株HA9801△trag。体外观察突变株HA9801△trag的基本生物学性状,发现其革兰氏染色及溶血性与野毒株相比没有明显变化,动物实验显示：野毒株对斑马鱼的LD50为3.8×104CFU／尾,trag块失株为4.9×105CFU／尾,毒力相比有所下降。为进一步探讨猪链球菌2型分子致病机理奠定了基础。3猪链球菌2型溶血素Ⅲ相关膜蛋白的表达溶血素Ⅲ相关膜蛋白位于89K毒力岛中。根据已发表的猪链球菌2型人源98HAH33株的溶血素Ⅲ相关膜蛋白的基因序列,分析选择免疫原性较高部分的基因序列设计和合成一对引物,扩增出这个蛋白部分基因并定向克隆到表达载体pET-32a(+)中,重组质粒通过PCR鉴定和测序后,转化入大肠杆菌BL21进行原核表达,SDS-PAGE显示表达产物约50kD, Western blot显示,其与猪源ZY05719株康复血清反应,抗原性良好。

全文目录

中文摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
第一篇文献综述  9-33
  第一章猪链球菌2型的研究进展  9-21
    1 病原学概况  9
    2 流行病学  9-10
    3 临床症状  10
    4 毒力因子  10-16
    参考文献  16-21
  第二章基因敲除方法及其应用  21-33
    1 基因敲除的策略  22-28
    2 基因敲除技术的应用  28-29
    3 展望  29-30
    参考文献  30-33
第二篇试验研究  33-65
  第三章猪链球菌2型毒力岛的检测  33-43
    摘要  33
    1 材料和方法  33-36
    2 结果  36-38
    3 讨论  38-40
    4 参考文献  40-41
    英文摘要  41-43
  第四章猪链球菌2型HA9801 trag基因缺失株的构建  43-55
    摘要  43-44
    1 材料和方法  44-46
    2 结果  46-50
    3 讨论  50-52
    4 参考文献  52-54
    英文摘要  54-55
  第五章猪链球菌2型溶血素Ⅲ相关膜蛋白的表达  55-65
    摘要  55
    1 材料和方法  55-59
    2 结果  59-61
    3 讨论  61-62
    4 参考文献  62-63
    英文摘要  63-65
全文总结  65-67
致谢  67

猪链球菌2型毒力岛的检测及trag基因缺失株的构建

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