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氟喹诺酮类对猪和鸡肝微粒体CYP1A2活性影响研究

作　者: 戴静
导　师: 袁宗辉
学　校: 华中农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 猪鸡肝微粒体 CYP1A2 氟喹诺酮类药物药物相互作用
分类号: S859
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

肝微粒体细胞色素P450酶系（Cytochrome P450,CYP450）是生物体内主要负责外源性物质和内源性物质Ⅰ相代谢的超家族酶系统。药物在被CYP450代谢的过程中可能对CYP450活性产生诱导与抑制作用,从而影响自身或其它药物的代谢。当多种药物联合使用时,这种酶活性改变可能会导致另外一种或几种药物代谢改变,出现药物失效甚至毒副作用,这也是临床上药物代谢性相互作用（Drug-druginteraction,DDI）产生的重要原因之一。为避免药物相互作用带来更大的损失,FDA先后于1997和2006年公布了相应的指导性文件以加强对药物的安全性评价与监测。兽医领域加强和完善兽药对CYP450活性影响的研究,对指导兽医临床合理和安全用药、预防和避免潜在的药物相互作用具有重要意义。氟喹诺酮类药物（Fluoroquinolones,FQs）是第三代含氟的新型喹诺酮类（Quinolones）药物,具有抗菌谱广、杀菌能力强、吸收分布广、不良反应小等显著特点,在兽医临床上得到了广泛的应用。CYP1A2是CYP450代谢酶系中的重要成员之一,参与临床上5%-10%常规药物的代谢。实验动物包括大鼠、小鼠、狗及人的研究表明FQs对肝微粒体CYP1A2亚型的活性存在抑制作用,这也是其与许多药物发生相互作用的重要原因。但目前尚无该类药物对食品动物猪和鸡肝微粒体CYP1A2活性影响研究的报道。由于种属差异的存在,单纯依靠种属外推来预测FQs对食品动物肝微粒体CYP1A2活性的影响存在很大的不足,因此有必要直接以食品动物为靶动物进行相关研究。本试验采用体外探针药物法研究了当前兽医临床常用的8种FQs包括环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、恩诺沙星、达氟沙星、二氟沙星、沙拉沙星对猪和鸡肝微粒体CYP1A2活性的影响,为其在兽医临床更合理和安全的使用提供科学依据。本试验主要包括以下三个方面的内容:1.肝微粒体CYP1A2活性检测体外探针药物法（HPLC-UV法）的建立及优化本试验以非那西丁O-去乙基反应（Phenacetin O-deethylation,POD）为探针检测肝微粒体CYP1A2亚型的活性。建立肝微粒体中非那西丁及扑热息痛同时检测的HPLC-UV法（梯度洗脱）。结果表明,猪和鸡肝微粒体中内源性物质均不干扰扑热息痛和非那西丁的测定,且猪和鸡肝微粒体中扑热息痛与非那西丁响应值与浓度均具有良好的线性关系,精密度和准确度均达到要求。差速离心法制备肝微粒体后测定CYP450差示光谱,考查探针药物非那西丁在微粒体中的代谢以检测肝微粒体活性,并建立肝微粒体体外孵育系统。结果表明,猪和鸡肝微粒体在450nm处有最大吸收,非那西丁在微粒体中能代谢生成扑热息痛,说明肝微粒体存在活性可用于代谢研究。采用共同孵育的方法考查6种常用的人源性CYP450抑制剂对猪和鸡肝微粒体非那西丁代谢的影响。结果表明,α-萘黄酮、花椒霉素和4-甲基吡酮均对猪肝微粒体中非那西丁O-脱乙基反应有抑制作用,其他抑制剂无显著影响,α-萘黄酮抑制作用最强,其K_i值为16.8μmol/L,是基于可逆抑制的非竞争性抑制作用:α-萘黄酮、磺胺苯吡唑、4-甲基吡酮、喹尼丁和花椒霉素均对鸡肝微粒体非那西丁O-脱乙基反应有抑制作用,其他抑制剂无显著影响,α-萘黄酮抑制作用最强,其K_i值为19.8μmol/L,是基于可逆抑制的非竞争性抑制作用。2.8种FQs对猪肝微粒体CYP1A2活性影响研究FQs（500μmol/L）在猪肝微粒体孵育系统中预先反应不同时间（0min、10min、20min、30min）后继续反应15min,绘制FQs的预反应时间-依赖性抑制图（TDI）确定抑制作用的类型;不同浓度的FQs（0、500、1000μmol/L）与非那西丁（1.25、2.5、5、10、20、40μmol/L）在猪肝微粒体孵育体系中反应15min,通过Linweaver-Burk法作图研究抑制作用产生的机制。结果表明8种FQs均对猪肝微粒体CYP1A2活性有较弱的抑制作用。环丙沙星、二氟沙星、沙拉沙星和洛美沙星产生的是基于不可逆抑制类型的非竞争性抑制作用,达氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星和诺氟沙星产生的是基于可逆抑制类型的非竞争性抑制作用。3.8种FQs对鸡肝微粒体CYP1A2活性影响研究FQs（500μmol/L）在鸡肝微粒体孵育系统中预先反应不同时间（0min、10min、20min、30min）后继续反应20min,绘制FQs的预反应时间-依赖性抑制图（TDI）确定抑制作用的类型:不同浓度的FQs（0、500、1000μmol/L）与非那西丁（2.5、5、10、20、40、80μmol/L）在鸡肝微粒体孵育体系中反应20min,通过Linweaver-Burk法作图研究抑制作用产生的机制。结果表明8种FQs均对鸡肝微粒体CYP1A2活性有较弱的抑制作用。环丙沙星产生的是基于不可逆抑制类型的非竞争性抑制作用,沙拉沙星产生的是基于不可逆抑制类型的竞争性抑制作用,达氟沙星和洛美沙星产生的是基于可逆抑制类型的非竞争性抑制作用,诺氟沙星、二氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星产生的是基于可逆抑制类型的竞争性抑制作用。本试验所建立的体外探针法可用于猪和鸡肝微粒体CYP1A2活性的检测。该方法具有取材方便、检测结果稳定、重复性好,特异性好、精确度高等优点。本试验所考查的FQs的K_i均远大于其在正常使用下的血药浓度C_max(K_i/C_max＞10),因此兽医临床上合理使用这8种FQs时均不会因其对CYP1A2活性的抑制作用而引发DDI。但是,由于不可逆抑制作用存在蓄积效应,因此临床上要尽量避免和减少环丙沙星、沙拉沙星、洛美沙星和二氟沙星的连续给药。本试验第一次得到了FQs对猪和鸡肝微粒体CYP1A2活性抑制的相关酶动力学参数,这对临床更加合理使用FQs、避免药物相互作用具有重要的指导意义。

全文目录

摘要  7-10
ABSTRACT  10-13
缩略语表  13-15
1 前言  15-23
  1.1 立项依据  15-16
  1.2 国内外研究进展  16-21
    1.2.1 FQs 与药物相互作用  16-18
    1.2.2 CYP1A2 与药物相互作用  18-19
    1.2.3 食品动物 CYP1A2 研究进展  19-20
    1.2.4 探针药物法在药物相互作用研究中的应用  20-21
  1.3 研究内容和目的意义  21-23
2 材料与方法  23-35
  2.1 药品和试剂  23-24
  2.2 溶液配制  24-25
  2.3 动物及饲养管理  25-26
  2.4 主要仪器和设备  26-27
  2.5 肝微粒体的制备  27-28
    2.5.1 肝微粒体蛋白浓度测定  27-28
    2.5.2 P450 差示光谱及含量测定  28
  2.6 探针药物 HPLC 检测方法建立  28-30
    2.6.1 色谱条件  28-29
    2.6.2 标准曲线的建立  29
    2.6.3 工作曲线的建立  29
    2.6.4 检测限与定量限  29
    2.6.5 准确度与精密度试验  29-30
    2.6.6 稳定性试验  30
  2.7 肝微粒体体外孵育系统建立  30-32
    2.7.1 蛋白浓度的优化  31
    2.7.2 反应时间的优化  31
    2.7.3 底物浓度的优化  31-32
    2.7.4 抑制剂对非那西丁代谢的影响  32
  2.8 FQs 对肝微粒体 CYP1A2 活性抑制作用的研究  32-35
    2.8.1 FQs 对肝微粒体 CYP1A2 活性的影响  32-33
    2.8.2 FQs 对肝微粒体 CYP1A2 活性抑制类型  33
    2.8.3 FQs 对肝微粒体 CYP1A2 活性抑制机制  33-35
3 结果  35-54
  3.1 肝微粒体非那西丁代谢体系  35-45
    3.1.1 肝微粒体组成特点  35-36
    3.1.2 探针药物 HPLC 方法学结果  36-38
    3.1.3 猪肝微粒体非那西丁代谢体系  38-42
    3.1.4 鸡肝微粒体非那西丁代谢体系  42-45
  3.2 FQs 对猪肝微粒体 CYP1A2 活性影响  45-49
    3.2.1 活性影响类型  45-47
    3.2.2 抑制作用类型  47
    3.2.3 抑制作用机制  47-49
  3.3 FQs 对鸡肝微粒体 CYP1A2 活性影响  49-54
    3.3.1 活性影响类型  49-51
    3.3.2 抑制作用类型  51
    3.3.3 抑制作用机制  51-54
4 讨论  54-65
  4.1 探针药物法的建立与考查  54-57
    4.1.1 肝微粒体代谢系统的建立  54-55
    4.1.2 探针药物的选择  55-56
    4.1.3 检测条件的建立  56
    4.1.4 探针药物法的优化  56-57
  4.2 FQs 介导药物相互作用分析  57-60
  4.3 FQs 抑制 CYP1A2 活性作用机理分析  60-65
    4.3.1 FQs 抑制 CYP1A2 活性的种属差异与同一性  61-63
    4.3.2 FQs 抑制 CYP1A2 活性的构效关系  63-65
5 结论  65-67
6 文献综述:食品动物药物代谢酶研究进展  67-80
  6.1 CYP450 概述  67
  6.2 CYP450 与药物相互作用  67-69
  6.3 CYP450 体外抑制研究方法  69-73
    6.3.1 荧光法  70
    6.3.2 生物发光法  70
    6.3.3 放射性法  70-71
    6.3.4 探针药物法  71-73
  6.4 食品动物药物代谢酶 CYP450 研究及进展  73-77
    6.4.1 猪药物代谢酶 CYP450 研究及进展  73-75
    6.4.2 禽类药物代谢酶 CYP450 研究及进展  75-76
    6.4.3 其它食品动物药物代谢酶 CYP450 研究及进展  76-77
  6.5 食品动物Ⅱ相代谢酶系研究及其进展  77-80
参考文献  80-93
致谢  93-94
附录  94-109
  附录 1: 个人简介  94-95
  附录 2: 定量分析方法原始数据  95-96
  附录 3: 药物抑制作用原始数据  96-103
  附录 4: 猪和鸡肝微粒体 CYP1A2 体外探针法标准化操作规范(SOP)  103-107
  附录 5: 答辩主要问题及回答  107-109

氟喹诺酮类对猪和鸡肝微粒体CYP1A2活性影响研究

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