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S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的提纯及应用

作　者: 何雪梅
导　师: 蒋洪敏
学　校: 中南大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: S-腺苷同型半胱氨酸水解酶 SDS-PAGE电泳层析技术蛋白免疫印迹技术
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 89次
引　用: 1次
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内容摘要

目的：为了获得高纯度有活性的SAHH,本实验在表达载体PQE30转化菌株E.coli BL21(DE3)成功构建的基础上,通过大量培养该菌来表达SAHH,利用层析方法来纯化SAHH,建立一套完整的纯化方案,并初步探讨其在生化试剂方面的应用。方法：1.在37℃以及摇床转速200rpm用1L LB肉汤培养基培养E.coli BL21(DE3),培养至对数期(OD600值约0.5),加入IPTG至浓度为0.5mmol/L诱导表达SAHH,诱导时间10h。2.采用匀浆法裂解细菌,通过硫酸铵分级沉淀得到蛋白酶SAHH的粗制品,再经Sepharose CL-6B Fast Flow、DEAE Sepharose Fast Flow以及Sephadex G-75层析柱进行细分离。3.采用SDS-PAGE电泳和蛋白免疫印迹技术鉴定表达及纯化产物。4.根据循环酶法测定Hcy的原理,相同条件下用已知试剂和替代试剂分别检测相同血清中Hcy含量,并采用配对样本t检验比较差异有无统计学意义。结果：1.E.coli BL21(DE3)在37℃、摇床转速200rpm、IPTG浓度为0.5mmol/L以及诱导10h的条件下成功表达SAHH。2.利用层析技术纯化SAHH,获得SDS-PAGE电泳近乎单一蛋白,提纯的酶制剂进行电泳后实施PVDF转膜,转膜结构也是单一条带。3.通过比较已知试剂和替代试剂检测相同血清中的Hcy含量,结果发现p>0.05,差异无统计学意义。结论：1.用经典的大肠杆菌表达系统成功表达SAHH,表达稳定,操作简便,污染小。2.本研究成功地分离纯化SAHH,整个提纯过程中SAHH较稳定,无降解。3.本研究初步证实纯化的SAHH具有一定的活性,在生化试剂应用上有一定的价值。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-10
第一部分前言  10-12
第二部分 S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的表达及鉴定  12-28
  第一章引言  12-14
  第二章材料与方法  14-23
  第三章结果  23-26
  第四章讨论  26-28
第三部分 SAHH的提纯及鉴定  28-43
  第一章引言  28-29
  第二章材料和方法  29-35
  第三章结果  35-41
  第四章讨论  41-43
第四部分 SAHH活性的初步测定及应用  43-52
  第一章引言  43-44
  第二章材料和方法  44-46
  第三章结果  46-50
  第四章讨论  50-52
第五部分结论  52-53
参考文献  53-57
综述  57-71
致谢  71-72
攻读学位期间主要研究成果  72

S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的提纯及应用

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