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猪源膜联蛋白A2的克隆、表达及其多克隆抗体的制备

作　者: 陈江涛
导　师: 刘艳红
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪膜联蛋白A2 多克隆抗体 亲和纯化 真核表达 同源模建 病毒
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


膜联蛋A2是膜联蛋白多基因家族成员之一,在钙离子存在时能与带负电荷的磷脂结合。近年来国内外研究发现病毒感染与膜联蛋白A2存在密切联系,在病毒学领域研究膜联蛋白A2及其他家族成员有助于从分子水平阐明病毒与宿主细胞相互作用,进一步揭示病毒致病机制和发展病毒性疾病防治策略。根据已知的猪源膜联蛋白A2序列(序列登录号:NM-001005726),从猪肺脏肺泡巨噬细胞中反转录并克隆出猪膜联蛋白A2,从pEGFP-1质粒中扩增出增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,用重组PCR技术构建了以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因和筛选标记的猪膜联蛋白A2-强型绿色荧光蛋白重组基因(ANXA2-EGFP),并把它克隆到pMD-18T载体,经酶切鉴定及序列测定,该重组基因开放阅读框正确。在此基础上,从重组pMD-18T载体(pA2-EGFP)扩增出猪膜联蛋白A2-EGFP重组基因,将其亚克隆进pET-30a(+)载体,构建了p30a/AE原核表达载体,以包涵体形式表达了66kD的猪膜联蛋白A2和增强型绿色荧光蛋白基因重组蛋白。同样地,从重组pMD-18T载体(pA2-EGFP)扩增出猪膜联蛋白A2全长基因,部分C端(142个氨基酸)及N端基因(52个氨基酸),分别将其亚克隆入pGEX-6P-1表达载体,构建了pGEX/A2,pGEX/CA2和pGEX/NA2原核表达载体,成功对猪膜联蛋白A2全长基因和部分C端(142个氨基酸残基)进行了可溶性表达;对于pGEX/NA2原核表达载体,通过更换宿主菌,IPTG梯度诱导和改变培养基pH,都未实现猪膜联蛋白A2 N端基因(52个氨基酸)的可溶性表达。用纯化的ANXA2-EGFP重组蛋白免疫兔子,收获血清后,先经辛酸-硫酸铵初步纯化,再用表达纯化的带GST标签的猪膜联蛋白A2全蛋白和带GST标签的猪膜联蛋白A2蛋白C端部分(142个氨基酸残基)偶联NHS活化琼脂糖凝胶FF树脂,对血清进行了亲和纯化,纯化后的血清效价可达12800,western blot鉴定显示出高特异性。将ANXA2-EGFP重组基因亚克隆入pcDNA3.1(+)表达载体,构建了pcDNA/A2-EGFP真核表达载体,转染PK-15细胞后,实现了瞬时表达,并用真核表达产物对亲和制备的多抗进行了验证,表明多抗可用。最后,用生物信息学方法模建了猪源膜联蛋白A2的三维立体结构,经PROCHECK和Anolea方法评估,模建质量较为理想。抗体是研究膜联蛋白A2与病毒相互作用的有力工具之一。本研究制备了效价高特异性强分别针对C端142个氨基酸残基和全蛋白的猪源膜联蛋白A2多抗,这有助于猪膜联蛋白A2的组织分布、相应配体封闭以及病毒感染后猪膜联蛋白A2上调表达的检测等进一步研究,为研究猪膜联蛋白A2与病毒感染的相互作用,揭示病毒的致病机制奠定了基础。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-15
第一章 序言  15-28
  1.1 研究目的和意义  15-16
  1.2 文献综述：膜联蛋白A2——病毒感染的全面参与  16-28
    1.2.1 膜联蛋白A2 及其异四聚体结构  17-19
    1.2.2 膜联蛋白A2——病毒感染的全面参与者  19-28
第二章 猪源膜联蛋白A2 和EGFP 基因的原核表达、纯化与鉴定  28-53
  实验一 猪源膜联蛋白 A2 和 EGFP 基因融合  28-41
    1.1 实验材料  28-30
      1.1.1 实验动物  28
      1.1.2 质粒及感受态细胞  28
      1.1.3 工具酶及试剂  28
      1.1.4 仪器  28-29
      1.1.5 主要溶液及配制  29-30
    1.2 实验方法  30-35
      1.2.1 猪肺脏肺泡巨噬细胞中总RNA 的提取  30
      1.2.2 PCR 融合引物的设计与合成  30-31
      1.2.3 猪膜联蛋白A2 基因的RT-PCR 扩增和EGFP 的PCR 扩增  31-33
      1.2.4 重组PCR 构建猪膜联蛋白A2-EGFP 融合基因  33
      1.2.5 猪膜联蛋白A2-EGFP 融合基因克隆到pMD-18T 载体  33-35
    1.3 结果  35-39
      1.3.1 总RNA 含量及甲醛变性电泳  35-36
      1.3.2 RT-PCR 扩增猪膜联蛋白A2  36
      1.3.3 PCR 扩增EGFP 基因  36-37
      1.3.4 重组PCR 构建A2-EGFP  37
      1.3.5 重组PCR 产物A2-EGFP 质粒鉴定  37-39
    1.4 讨论  39-41
  实验二 猪膜联蛋白 A2 和增强型绿色荧光蛋白融合基因的原核表达、纯化与鉴定  41-53
    1.1 实验材料  41-44
      1.1.1 质粒及感受态细胞  41
      1.1.2 工具酶及试剂  41
      1.1.3 仪器  41-42
      1.1.4 主要溶液及培养基配制  42-44
    1.2 实验方法  44-48
      1.2.1 猪膜联蛋白A2 和增强型绿色荧光蛋白融合基因原核表达载体的构建  44-46
      1.2.2 重组表达质粒的诱导表达及表达产物的纯化  46-47
      1.2.3 表达产物的western blot 鉴定  47-48
    1.3 结果  48-51
      1.3.1 重组表达质粒PCR 和酶切鉴定  48-49
      1.3.2 重组表达质粒的诱导表达  49
      1.3.3 重组表达质粒的可溶性分析  49-50
      1.3.4 目的蛋白的分离纯化和含量测定  50
      1.3.5 诱导表达蛋白的Western blot 鉴定  50-51
    1.4 讨论  51-53
第三章 猪膜联蛋白A2 全长及部分C 端和N 端基因的原核表达  53-69
  1.1 实验材料  53-54
    1.1.1 质粒及感受态细胞  53
    1.1.2 工具酶及试剂  53
    1.1.3 仪器  53
    1.1.4 主要溶液及培养基  53-54
  1.2 实验方法  54-60
    1.2.1 猪膜联蛋白A2 全长基因原核表达载体的构建  54-58
    1.2.2 重组表达质粒的诱导表达及表达产物的纯化  58
    1.2.3 表达产物的western blot 鉴定  58-59
    1.2.4 猪膜联蛋白A2 全长蛋白（IA2）的Ca2+依赖性磷脂结合活性  59-60
  1.3 结果  60-67
    1.3.1 重组表达质粒的鉴定  60-61
    1.3.2 重组表达质粒的诱导表达及可溶性分析  61-64
    1.3.3 目的蛋白的分离纯化和含量测定  64-65
    1.3.4 表达产物的western blot 鉴定  65-67
    1.3.5 全长猪膜联蛋白A2（IA2）的Ca2+依赖性磷脂结合活性检测  67
  1.4 讨论  67-69
第四章 猪膜联蛋白A2 多克隆抗体的制备、亲和纯化与鉴定  69-79
  1.1 实验材料  69-71
    1.1.1 免疫抗原  69
    1.1.2 试剂  69
    1.1.3 实验动物  69
    1.1.4 主要仪器  69
    1.1.5 溶液配制  69-71
  1.2 实验方法  71-74
    1.2.1 免疫方案  71
    1.2.2 多克隆抗体的收集和纯化  71-73
    1.2.3 间接ELISA 检测多克隆抗体效价  73-74
    1.2.4 多克隆抗体的western blot 特异性检测  74
  1.3 结果  74-77
    1.3.1 多抗效价分析  74-76
    1.3.2 抗体纯化分析  76-77
    1.3.3 Western blot 检测抗体特异性  77
  1.4 讨论  77-79
第五章 猪膜联蛋白A2 真核表达载体的构建及其在PK-15 细胞中的瞬时表达  79-87
  1.1 实验材料  79-80
    1.1.1 质粒及感受态细胞  79
    1.1.2 工具酶及试剂  79
    1.1.3 仪器  79-80
    1.1.4 主要溶液及培养基  80
  1.2 实验方法  80-83
    1.2.1 猪膜联蛋白A2-EGFP 真核表达载体的构建  80-82
    1.2.2 重组表达载体转染PK-15 细胞  82
    1.2.3 表达产物的western blot 鉴定  82-83
  1.3 结果  83-86
    1.3.1 重组表达质粒的鉴定  83
    1.3.2 猪Annexin A2 在PK-15 细胞中的瞬时表达  83-84
    1.3.3 表达产物的western blot 鉴定  84-86
  1.4 讨论  86-87
第六章 猪源膜联蛋白A2 的结构预测及同源模建  87-96
  1.1 材料  87-88
    1.1.1 氨基酸序列  87
    1.1.2 所用软件  87-88
  1.2 方法  88
    1.2.1 猪源膜联蛋白A2 的一级结构分析  88
    1.2.2 疏水性、抗原表位、亚细胞定位、结构域、跨膜区和信号肽预测及分析  88
    1.2.3 猪源膜联蛋白A2 二级结构分析  88
    1.2.4 猪源膜联蛋白A2 三级结构的同源模建  88
  1.3 结果与分析  88-95
    1.3.1 猪源膜联蛋白 A2 的一级结构分析  88
    1.3.2 疏水性、抗原表位、亚细胞定位、结构域、跨膜区和信号肽预测分析  88-90
    1.3.3 猪源膜联蛋白 A2 二级结构分析  90
    1.3.4 猪源膜联蛋白 A2 三级结构的同源模建分析  90-95
  1.4 讨论  95-96
第七章 研究结论  96-97
参考文献  97-107
附录  107-114
  附录 1:载体构建  107-112
  附图 2:猪源膜联蛋白 A2 氨基酸序列相似性比对  112-114
致谢  114-115
作者简介  115

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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