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猪胆管的生物力学特性及作为组织工程胆管的可行性

作　者: 李文春
导　师: 宋健
学　校: 武汉大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 胆总管生物力学异种移植细胞外基质组织工程支架材料
分类号: R318.0
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景：胆道手术是外科手术的难点,术中损伤胆管的修复、修复后发生再狭窄以及胆道恶性狭窄的治疗一直是腹部外科的难题。人们一直在试图设计一种可以代替胆管结构和功能的人工胆管,来解决胆管修复与重建的难题。同种异体移植已经在临床工作中广泛开展,但术后对于排斥反应的预防和治疗仍有很多问题需要解决,而且对于胆管的移植仍然无法完全解决术后狭窄梗阻和Oddi括约肌功能恢复的问题。近年来,由于人类器官短缺,异种移植已经成为当今器官移植学的新领域。为有效解决器官短缺问题,这就有必要探讨新的供体材料。猪是目前被认为最有可能进行人类异种器官移植的动物。国内外学者虽已将猪到人异种移植进行了实验研究和临床应用,但对异种移植所涉及的猪胆管的力学特性的比较研究国内外报道很少。转基因动物作为器官移植的供体受到重视,培育表达人类补体调节蛋白的转基因猪已告成功,超急性排斥反应已被克服,从而使猪到人异种器官移植极具吸引力和挑战性。异种移植供源,除了满足生理功能和克服免疫原性的障碍外,其解剖学和生物力学的匹配性也是移植成功与否的重要因素,这就有必要从生物力学角度探讨猪胆总管作为异种移植器官和作为组织工程胆管材料可行性。第一部分猪胆管作为人胆管移植替代材料的生物力学评价目的：通过对猪与人胆总管生物力学的比较研究,探讨其生物力学特性之间的关系,从生物力学方面评价猪胆总管作为人胆管移植替代材料的可行性。方法：健康2月龄湖北白猪50头(雄性30头,雌性20头),随机分为10组。普食饲养,分别于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月龄时用氯胺酮肌肉注射(5mg/kg)麻醉宰杀5头(雄性3头,雌性2头),测量胆总管在体长度后取出。人胆总管取自无肝胆疾病、年龄在20-40岁意外死亡的5例成年尸体。每个标本做5μm冰冻横断面切片,H-E法染色。用计算机图像分析仪测量胆总管的壁厚和直径等几何形态学指标。用e-ruler计算机软件测量胆总管的张开角。用生物力学试验机对胆总管进行压力—直径关系试验,计算出增量弹性模量(identical incremental elastic modulus, Einc),压力-应变弹性模量(pressure-strain elastic modulus, Ep),容积弹性模量(volume elastic modulus, Ev)和顺应性(compliance, C)等力学特性参数。免疫组织化学的方法染色,用激光共聚焦显微镜检测胆总管壁胶原纤维、平滑肌和弹性纤维的荧光定量表达,计算显微结构成份的含量。结果：1.猪的体重、肝的重量和体积随月龄的变化：猪的体重、肝的重量和体积随着月龄的增加而增大,6-7月龄猪的体重、肝的重量和体积与成人的相近(F=109.15,P=0.08)。2.猪与人胆总管几何形态的比较：人与各月龄组猪胆总管的壁厚(F=6.46,P=0.00)、直径(F=9.56,P=0.00)和长度(F=13.29,P=0.00)在总体上差异有统计学意义；3-6月龄猪胆总管的壁厚和直径比成人的小(P<0.01),7-10月龄猪胆总管的壁厚和直径与成人的相近(P>0.05)；各月龄组猪胆总管的长度均比成人的短(P<0.01)。3.猪与人胆总管张开角的比较：3-12月龄猪胆总管的张开角随月龄增加而逐渐增大(P<0.05),7月龄时趋于稳定。7-12月龄猪胆总管的张开角变化不明显,且与成人的相近(P>0.05)。4.猪和人胆总管的弹性模量与压力的关系：猪与人胆总管的Einc、Ep和Ev均随压力的上升而增大,当压力达4kPa时,胆总管的直径不再变化,弹性模量也随之不变或变化很小,曲线趋于平缓。5.人与猪胆总管弹性模量的比较：单因素方差分析显示,人与各月龄组猪胆总管的Einc(F=502.08,P=0.00)、Ep(F=137.42,P=0.00)和Ev(F=134.59,P=0.00)在总体上差异有统计学意义；3-6月龄及11、12月龄猪的弹性模量比成人的大(P<0.01),7-10月龄猪胆总管的弹性模量与成人的相近(P>0.05)。6.各月龄猪胆总管顺应性的变化：猪胆总管的顺应性先随月龄增加而增大,10月龄后又减小。猪胆总管顺应性随月龄的变化与弹性模量相反。7.人与猪胆总管顺应性的比较：单因素方差分析显示,人与各月龄组猪胆总管的顺应性在总体上差异有统计学意义(F=62.93,P=0.00)；7-10月龄猪胆总管的顺应性与成人的相近(P>0.05),而3-6月龄及11、12月龄猪胆总管的顺应性明显小于成人(P<0.01)。8.人与猪胆总管的显微结构成分的含量：猪与人胆总管组织结构相似。各月龄组猪胆总管的平滑肌(F=89.85,P=0.001)、胶原纤维(F=273.69,P=0.003)和弹性纤维(F=182.60,P=0.006)的含量随月龄的而变化。其中平滑肌和弹性纤维的含量随月龄的增加而增多,胶原纤维的含量和胶原纤维/弹性纤维比值(Collagen/Elastin, C/E值)随月龄的增加而减少。7-10月龄猪胆总管的平滑肌、胶原纤维和弹性纤维的含量与成人的差异不明显(P>0.05)。结论：猪胆总管的生物力学特性随年龄的变化而变化。7-10月龄猪胆总管的几何形态、张开角、弹性模量、顺应性和显微结构成分等生物力学特性与成人的比较匹配。从猪胆总管的年龄和生物力学特性的相关性提示,7-10月龄猪的胆总管作为人异种移植胆管供源是可能的。第二部分猪胆管脱细胞支架的制备及组织学和生物力学评价目的：用不同的脱细胞方法对猪胆总管进行处理,从猪胆总管脱细胞前后的组织学和生物力学特性方面进行评价,探索一种合适的脱细胞方法,为组织工程胆管支架材料的应用提供理论和实验依据。方法：1.分组：30段猪胆总管,沿纵轴制作成30mm×12mm的样本,随机分为5组(每组6例)：新鲜对照A组及脱细胞B组、脱细胞C组、脱细胞D组和脱细胞E组。2.脱细胞处理：分别用四种方法脱细胞(B组：0.05%胰蛋白酶+核酸酶,C组：0.1%SDS+核酸酶,D组：1.0%Triton X-100+核酸酶,E组：1.0%Triton X-100+0.1%SDS+核酸酶)。处理过程为37℃恒温下持续振荡24h.PBS液反复漂洗。3.脱细胞效果观察：HE染色,光镜观察脱细胞基质的组织结构和细胞残留情况。4.脱细胞基质的核酸(DNA)含量测定：用紫外分光光度法检测脱细胞基质的DNA含量,计算脱细胞率5.生物力学试验：将标本均沿纵轴裁成20mm×10mm的样本条,在TestResources生物力学试验机上进行加载一卸载试验和极限抗张强度试验。计算出生物力学材料常数(α1、β1、α2、β2)、弹性模量、极限抗张强度和断裂伸长率等指标。结果：1.光镜观察证实,四种方法脱细胞后,猪胆总管壁的细胞不同程度被去除。脱细胞B组有少量细胞残留,纤维有损伤；脱细胞C组、D组、E组的细胞均被去除,纤维无明显损伤。2.A组的DNA含量为71.24±2.56μg/100mg。B、C、D、E4个脱细胞组的DNA含量与A组的差异有统计学意义(F=15.29,P=0.00),4个组均有明显的脱细胞效果(P<0.01),B组的脱细胞率为77.03%,比C组、D组、E组的脱细胞效果稍差(P<0.05),E组的脱细胞率高达99.03%。3.D、E2个脱细胞组胆总管的生物力学材料常数(α1、β1、α2、β2)与A组的差异无统计学意义(F=12.21,P=0.06),B组、D组比A组、C组和E组的小(P<0.01),D组和E组2个脱细胞组之间差异不明显(P>0.05),E组的更接近A组。4.D组、E组2个脱细胞组胆总管的弹性模量比A组的稍增大,但差异不明显(P>0.05),B组、C组比A组的小(P<0.05),D组和E组2个脱细胞组之间差异不明显(P>0.05)。5.脱细胞D组、E组的UTS值和SOF值与A组差异不明显(P>0.05)；脱细胞B组、C组的UTS值明显小于A组(P<0.05),SOF值明显大于A组(P<0.05)；脱细胞D组、E组的UTS值和SOF值之间无明显差异(P>0.05)。结论：1.0.05%胰蛋白酶+核酸酶组的脱细胞效果欠佳,DNA剩余量较多,胆总管ECM结构完整性受到了破坏,生物力学特性变化表现为材料常数变小,刚度变小、强度明显降低和伸展性增加。2.0.1%SDS+核酸酶组的脱细胞效果虽然好,但生物力学特性发生了与B组相似的改变。3.1.0%Triton X-100+核酸酶和1.0%Triton X-100+0.1%SDS+核酸酶2个组的脱细胞效果好,且不会影响猪胆总管的生物力学特性,前者的脱细胞率为95.42%,而后者的脱细胞率高达99.03%,能更好地降低胆总管的免疫原性,是一种比较理想的猪胆总管脱细胞方法。4.从免疫原性和生物力学角度考虑,1.0%Triton X-100+0.1%SDS+核酸酶的脱细胞方法制成的脱细胞猪胆总管,是构建组织工程胆管的良好支架材料。

全文目录

中文摘要  9-13
Abstract  13-19
引言  19-23
第一部分猪胆管作为人胆管移植替代材料的生物力学评价  23-50
  材料和方法  25-32
  结果  32-45
  讨论  45-49
  结论  49-50
第二部分猪胆管脱细胞支架的制备及组织学和生物力学评价  50-71
  材料和方法  51-57
  结果  57-65
  讨论  65-70
  结论  70-71
参考文献  71-77
综述  77-84
  参考文献  81-84
攻读博士期间发表的科研成果目录  84-85
后记  85

猪胆管的生物力学特性及作为组织工程胆管的可行性

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