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人参炔三醇对CYP3A介导的咪达唑仑不同羟化代谢影响的机制研究

作　者: 何芳
导　师: 夏春华
学　校:
专　业: 药理学
关键词: 肝微粒体咪达唑仑羟化代谢人参炔三醇 CYP3A酶活性机制
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景：前期通过固相萃取、色谱逐级分离、波谱分析及结构鉴定等多种技术手段，确定人参炔三醇（Panaxytriol, PXT）为对咪达唑仑不同羟化代谢通路产生差异影响的物质，即抑制其4-羟化代谢，而激活其1′-羟化代谢。本课题通过大鼠肝微粒、人肝微粒体及大鼠原代肝细胞代谢模型，探讨PXT对CYP3A介导的MDZ不同羟化代谢通路影响的机制。目的：通过肝微粒体体外代谢方法从酶多结合位点角度分析人参炔三醇对CYP3A酶动力学的影响；并通过测定大鼠原代肝细胞中CYP3A探针底物咪达唑仑不同羟化代谢情况，反应人参炔三醇对CYP3A酶活性的影响；最后RT-PCR实验测定CYP3A1/2mRNA的表达情况，综合分析人参炔三醇对CYP3A介导的MDZ不同羟化代谢通路的影响机制，为临床安全合理用药提供科学依据。方法：1、PXT对大鼠及人肝微粒体中CYP3A介导的MDZ羟化代谢影响。①建立咪达唑仑在大鼠及人肝微粒体中的孵育方法及样品处理方法。建立温孵体系中咪达唑仑4-羟化及1′-羟化代谢产物的HPLC检测方法。②分析不同浓度人参炔三醇（0、0.5、1.0、2.0μg/ml）对肝微粒体中咪达唑仑不同羟化代谢酶促反应动力学参数的影响（Km、Vmax、CLint）。2、PXT对大鼠原代肝细胞中CYP3A介导的MDZ羟化代谢影响。①建立大鼠原代肝细胞的分离及纯化方法。通过台盼蓝排斥实验测定肝细胞的活性及产率，运用光学显微镜观察肝细胞的显微结构。通过MTT实验测定MDZ、PXT对肝细胞的毒性作用，建立肝细胞样品中4-OH-MDZ及1′-OH-MDZ的LC-MS检测方法。分别从培养时间、肝细胞接种密度、底物浓度三个方面考察MDZ在大鼠原代肝细胞中4-羟化及1′-羟化代谢的酶促动力学特征。②研究CYP3A诱导剂地塞米松（Dexamethasone, DEX）、抑制剂酮康唑（Ketoconazole, KTZ）、实验组人参炔三醇（PXT）与MDZ在大鼠原代肝细胞中分别培养45min、4h、6h后，对MDZ4-羟化及1′-羟化代谢的影响。3、PXT对大鼠原代肝细胞中CYP3A1/2mRNA表达的影响。PXT与大鼠原代肝细胞分别培养45min、6h后，RT-PCR电泳检测PXT对大鼠原代肝细胞中CYP3A1/2mRNA表达的影响。结果：1、PXT对大鼠及人肝微粒体中CYP3A介导的MDZ羟化代谢影响。①建立了高效灵敏的微粒体样品4-OH-MDZ及1′-OH-MDZ的HPLC检测方法，符合分析检测要求。②PXT抑制肝微粒体中MDZ的4-羟化代谢，激活其1′-羟化代谢。在RLM中，PXT浓度分别为0、0.5、1.0、2.0μg/ml时，4-OH-MDZ的酶动力学参数Vmax由0.72nmol/min.mg pro逐渐减小至0.51nmol/min.mg pro，Km由5.12μM逐渐增加至7.26μM。CLint=Vmax/Km，CLint由0.14逐渐减小至0.07ml/min.mg pro，4-OH-MDZ的酶动力学参数在HLM中也呈现相同的趋势。通过双位点模型求算RLM中1′-OH-MDZ酶动力学参数Vmax1由0.38增加至0.84nmol/min.mg pro，Km1由8.9降低至5.4μM，CLint（Vmax1/Km1）由0.04增加至0.16ml/min.mg pro，在HLM中PXT对MDZ的1′-羟化代谢表现出相同的激活效果。2、PXT对大鼠原代肝细胞中CYP3A介导的MDZ羟化代谢影响。①建立了成熟稳定的大鼠原代肝细胞分离方法，肝细胞活力较高达85%，产率为（0.4-0.8）ｘ10~8/肝。建立了快速有效的肝细胞样品中4-OH-MDZ及1′-OH-MDZ的LC-MS检测方法，并且MTT实验确定MDZ、PXT浓度分别在1.0-40.0μM，0.5-20μg/ml范围内对肝细胞毒性较小。培养时间为0-120min，肝细胞接种密度为（0.75-3.0）ｘ10~6/ml，MDZ浓度为1-10μM范围内，4-OH-MDZ及1′-OH-MDZ代谢产物基本呈线性增加；MDZ浓度达到10μM时，4-羟化及1′-羟化代谢产物近似达到饱和，符合经典的酶动力学特征。②与肝微粒体实验结果一致，PXT（0、1.0、4.0、8.0μg/ml）与MDZ在大鼠原代肝细胞中共同培养45min后，对MDZ的不同羟化代谢产生差异作用，即抑制其4-OH代谢，激活其1′-羟化代谢。随着培养时间的延长，PXT对咪达唑仑4-羟化代谢的抑制作用增强，并且对1′-羟化代谢也表现出抑制作用，PXT（1.0、4.0、8.0μg/ml）与MDZ共同培养6h后，与空白组相比1′-OH-MDZ分别降低为82.3%、68.2%、59.0%。提示PXT可能对肝细胞中CYP3A酶代谢活性产生抑制作用。3、PXT对大鼠原代肝细胞中CYP3A1/2mRNA表达的影响。PXT（2.0、4.0、8.0μg/ml）与大鼠原代肝细胞培养45min后，不影响肝细胞中CYP3A1/2mRNA表达水平；培养6h后，PXT（2.0μg/ml）不影响CYP3A1/2mRNA的表达水平，PXT（4.0、8.0μg/ml）使CYP3A1mRNA的表达分别降低为87%、80%，使CYP3A2mRNA的表达分别降低为89%、85%。结论：本实验通过大鼠及人肝微粒体体外代谢研究方法，根据酶多结合位点从酶动力学角度分析PXT对CYP3A介导的MDZ羟化代谢的影响。通过大鼠原代肝细胞体外代谢模型及RT-PCR实验，证实PXT对大鼠原代肝细胞中CYP3A酶的抑制作用在酶代谢活性水平及CYP3A1/2mRNA的表达水平上显示良好的一致性。分别从酶动力学角度、CYP3A酶代谢活性的变化以及CYP3A1/2mRNA表达水平三个方面，综合阐明人参炔三醇对CYP3A介导的MDZ不同羟化代谢通路的影响机制，为指导临床安全合理用药提供科学依据。

全文目录

摘要  3-6
ABSTRACT  6-13
中英文缩略词表  13-14
第1章引言  14-16
第2章 PXT 对大鼠及人肝微粒体中 CYP3A 介导的 MDZ 羟化代谢影响  16-26
  2.1 材料  16-17
    2.1.1 主要仪器  16
    2.1.2 主要药品与试剂  16-17
  2.2 方法  17-18
    2.2.1 溶液的配制  17
    2.2.2 NADPH 温孵体系及样品处理方法  17
    2.2.3 MDZ、4-OH-MDZ 及 1′-OH-MDZ 的 HPLC 测定条件  17
    2.2.4 PXT 对 RLM 中 CYP3A 介导的 MDZ 羟化代谢影响  17-18
    2.2.5 PXT 对 HLM 中 CYP3A 介导的 MDZ 羟化代谢影响  18
    2.2.6 数据分析  18
  2.3 结果  18-24
    2.3.1 4-OH-MDZ 及 1′-OH-MDZ HPLC 方法学评价  18-20
    2.3.2 PXT 对 RLM 中 CYP3A 介导的 MDZ 羟化代谢影响  20-21
    2.3.3 PXT 对 HLM 中 CYP3A 介导的 MDZ 羟化代谢影响  21-22
    2.3.4 PXT 对 RLM 及 HLM 中 CYP3A 介导的 MDZ 羟化代谢动力学影响  22-24
  2.4 讨论  24-26
第3章 PXT 对大鼠原代肝细胞中 CYP3A 介导的 MDZ 羟化代谢影响  26-47
  3.1 材料  26-27
    3.1.1 实验动物  26
    3.1.2 主要仪器与设备  26
    3.1.3 主要药品与试剂  26-27
  3.2 方法  27-32
    3.2.1 溶液的配制  27-28
    3.2.2 大鼠原代肝细胞的分离  28
    3.2.3 4-OH-MDZ、1′-OH-MDZ 的 LC-MS 检测条件  28-29
    3.2.4 肝细胞样品处理过程  29
    3.2.5 MDZ、PXT 对大鼠原代肝细胞的毒性作用  29-30
    3.2.6 大鼠原代肝细胞中蛋白含量的测定（BCA 法）  30
    3.2.7 细胞代谢活性的测定  30-31
    3.2.8 MDZ 在大鼠原代肝细胞中的代谢条件的确定  31
    3.2.9 PXT、DEX 及 KTZ 对咪达唑仑 4-OH 及 1′-OH 代谢通路的影响.  31-32
    3.2.10 数据处理  32
  3.3 结果  32-44
    3.3.1 大鼠原代肝细胞的形态学、活率  32-33
    3.3.2 4-OH-MDZ、1′-OH-MDZ LC-MS 测定方法的评价  33-35
    3.3.3 MDZ、PXT 对大鼠原代肝细胞的毒性作用  35-36
    3.3.4 大鼠原代肝细胞中蛋白含量的测定（BCA 法）  36
    3.3.5 细胞代谢活性测定结果  36-37
    3.3.6 咪达唑仑在大鼠原代肝细胞中的代谢  37-40
    3.3.7 PXT、DEX 及 KTZ 对 MDZ 不同羟化代谢通路的影响  40-44
  3.4 讨论  44-47
第4章 PXT 对大鼠原代肝细胞中 CYP3A1/2 mRNA 表达的影响  47-55
  4.1 材料  47-48
    4.1.1 实验动物  47
    4.1.2 主要仪器与设备  47
    4.1.3 主要药品与试剂  47-48
  4.2 方法  48-50
    4.2.1 PXT 对大鼠原代肝细胞中 CYP3A1/2mRNA 表达的影响  48
    4.2.2 RT-PCR 反应  48-50
    4.2.3 数据处理  50
  4.3 结果  50-53
    4.3.1 RNA 的电泳结果  50
    4.3.2 PXT 对大鼠原代肝细胞中 CYP3A1 mRNA 表达的影响  50-52
    4.3.3 PXT 对大鼠原代肝细胞中 CYP3A2 mRNA 表达的影响  52-53
  4.4 讨论  53-55
第5章结论与展望  55-57
  5.1 结论  55
  5.2 展望  55-57
致谢  57-58
参考文献  58-62
攻读学位期间的研究成果  62-63
综述  63-74
  参考文献  70-74

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