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丙酸杆菌的耐药研究及盐酸小檗碱对耐药株的抑制机制研究

作　者: 曾宪玉
导　师: 杨志波
学　校: 湖南中医药大学
专　业: 中医外科学
关键词: 丙酸杆菌红霉素克林霉素四环素 ermX ermX(cj) Tn5432
分类号: R758.733
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：研究从痤疮患者皮损中分离的丙酸杆菌对红霉素、克林霉素和四环素的药敏情况及耐药机制,研究盐酸小檗碱对丙酸杆菌的抑制作用并探讨其可能机制。方法：分离丙酸杆菌,厌氧培养经革兰染色、16SrRNA和23SrRNA测序等方法鉴定,采用E-test方法检测分离株对红霉素、克林霉素和四环素的MIC值,PCR扩增ermX、ermX (cj)、IS1249a、IS1249b并测序。采用微量肉汤稀释法检测盐酸小檗碱对丙酸杆菌的MIC值,采用real time PCR方法研究小檗碱是否调节erm基因的表达和逆转23S rRNA点突变。结果：共分离84株丙酸杆菌,72株、12株分别鉴定为痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes, P.acnes)、贪婪丙酸杆菌(Propionibacterium avidum,P.avidum)。所有菌株对四环素敏感。29株(34.52%)对红霉素耐药,均为高度耐药(MIC>25μg/ml)；其余55株对红霉素敏感。19株P.acnes耐药株中,16株对克林霉素高度耐药(MIC>256μg/ml)；10株P. avidum对克林霉素高度耐药(MIC>256μg/ml)。19株P.acnes耐药株中,7株在相当于Escherichia coli23S rRNA2058位点发现由A→G点突变,均对红霉素和克林霉素高度耐药；4株在相当于E.coli23S rRNA2059位点发现由A→G点突变,其中1株对克林霉素耐药,3株敏感；另外8株P.acnes扩增ermX阳性,其序列与Genbank中P.acnes ermX基因100%同源。10株P. avidum中,2株ermX扩增阳性,其序列与P.acnes ermX基因100%同源；另外8株扩增ermX (cj)得到预期片段PCR产物,与Genbank中Corynebacterium jeikeium ermX (cj)99%同源,而与P.acnes ermX仅有94%的同源性。10株扩增ermX基因阳性的菌株扩增IS1249a和IS1249b均阳性,而其余菌株均阴性。盐酸小檗碱对丙酸杆菌的MIC值在1-8μg/ml,未发现其有调控erm基因、逆转23SrRNA点突变的作用。经盐酸小檗碱溶液共孵育后的耐药P. acnes透射电镜下可见DNA扭曲碎裂、细胞核固缩、空泡化。结论：本研究中痤疮患者携带的丙酸杆菌包括P. acnes对红霉素耐和克林霉素耐药率高,对四环素敏感。对红霉素和克林霉素的耐药与在相当于E.coli23S rRNA2058、2059位点由A→G点突变、携带ermX(cj)基因及位于转座子Tn5432中的ermX基因相关。盐酸小檗碱对耐药和敏感丙酸杆菌均有较好的抑制作用,其MIC值在1-8μg/ml,其不是通过抑制erm基因、逆转23SrRNA点突变介导抑制。透射电镜下观察经盐酸小檗碱孵育后,丙酸杆菌DNA结构破坏、胞核固缩空泡化,提示其可能通过整体抑制DNA发挥作用,是否通过抑制FtsZ蛋白或与DNA结合后诱发SOS反应抑制丙酸杆菌,有待在今后的研究中进一步探讨

全文目录

中文摘要  5-7
Abstract  7-9
引言  9-11
第一部分痤疮患者皮损中分离丙酸杆菌的耐药及耐药机制研究  11-23
  1.1 资料和方法  11-13
    1.1.1 临床资料  11
    1.1.2 试剂和仪器  11
    1.1.3 从痤疮患者皮损中分离丙酸杆菌、保存  11
    1.1.4 DNA提取  11-12
    1.1.5 引物、PCR和测序  12
    1.1.6 革兰染色  12-13
    1.1.7 E-test药敏方法  13
    1.1.8 统计学处理  13
  1.2 结果  13-23
    1.2.1 分离株革兰染色鉴定  13-14
    1.2.2 16S rRNA和23S rRNA测序Blast结果  14-16
    1.2.3 药敏结果  16-17
    1.2.4 23S rRNA和erm基因测序结果  17-21
    1.2.5 IS1249a和IS1249b扩增结果  21-23
第二部分盐酸小檗碱对丙酸杆菌耐药株的抑制作用及机制探讨  23-34
  2.1 材料和方法  23-28
    2.1.1 试剂和仪器  23-24
    2.1.2 药敏试验  24-25
    2.1.3 盐酸小檗碱抑制丙酸杆菌生长曲线的观察  25
    2.1.4 盐酸小檗碱对丙酸杆菌的抑制作用：透射电镜观察  25-26
    2.1.5 引物及DNA提取  26-27
    2.1.6 实时荧光定量PCR  27-28
  2.2 结果  28-34
    2.2.1 盐酸小檗碱对耐药丙酸杆菌的抑制作用  28
    2.2.2 盐酸小檗碱对strain ermX丙酸杆菌的生长曲线抑制作用  28-29
    2.2.3 透射电镜下观察盐酸小檗碱对耐药丙酸杆菌的调控作用  29-31
    2.2.4 盐酸小檗碱孵育丙酸杆菌后erm基因扩增结果  31
    2.2.5 盐酸小檗碱对耐药丙酸杆菌的ermX基因及23S rRNA点突变的调控作用  31-34
第三部分讨论  34-42
第四部分结论  42-43
致谢  43-44
参考文献  44-48
附录一：综述  48-55
  参考文献  52-55
附录二：博士研究生期间发表论文及主持课题  55

丙酸杆菌的耐药研究及盐酸小檗碱对耐药株的抑制机制研究

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